桃仁红花煎治疗心血管疾病的计算药理学研究

荣毅桢　侯亚飞　徐顺

摘 要：通过理论计算方法研究桃仁红花煎治疗心血管疾病的药理学行为。首先将从桃仁红花煎各味中药中分离得到的672个小分子与30个与心血管疾病有关的靶标（55个结合位点）进行初步对接，筛选出活性成分，构建小分子——靶标相互作用网络；接下来将虚拟筛选出来的活性较高的分子与部分靶标作进一步的精细对接，研究其相互作用机理，为治疗心血管疾病的新药设计和开发提供指导。

关键词：桃仁红花煎；心血管疾病；分子对接；计算药理学

桃仁红花煎出自《素庵医案》，主要由红花、当归、桃仁[1]、香附、延胡索、赤芍、川芎、丹参[2]、青皮、生地黄组成。以桃仁、红花为主药，配香附、延胡索、青皮行气以活血，丹参尤属要物，研究表明其对心血管疾病有较好的治疗作用，与赤芍配伍有抗凝血作用，而与川芎、赤芍、生地黄等配伍则有预防血栓形成的功效。临床表明桃仁红花煎具有降低血压、有效对抗动脉粥样硬化、保护心血管的效果[3]。然而对该方剂具体的药理学研究很少。中药体系成分复杂，具有与多种药靶作用，调控多种生物途径的复杂作用机理，因此在分子水平研究中药作用机理有很大的难度。近年来，随着计算化学的发展，人们已经注意到通过计算药理学研究探讨中药可能的作用机理[4-7]，对中药现代化研究可能是一条有效的途径。

本文利用桃仁红花煎已分离得到的672个化合物分子，再结合一些重要的与心血管疾病有关的靶标，运用理论计算方法研究桃仁红花煎的药理学性质，并筛选出活性成分，为新药的设计与开发提供指导。

1 桃仁红花煎中有效成分的虚拟筛选

1.1 桃仁红花煎中含有小分子化合物的收集

通过查阅大量文献和数据库搜集到中药方剂桃仁红花煎中十味中药中已分离得到的化合物672种，均已被确定结构。然后用Cerius2软件对结构进行优化，并对最优构象进行加氢及能量优化，保存为TRHHJ.sd文件。

1.2 分子对接与打分

在DrugBank数据库及PDB数据库筛选出30个与心血管疾病相关的靶标，其中包括环氧化酶、白细胞介素、血管紧张素转化酶、肿瘤坏死因子等30个靶酶，共55个结合位点。将672个化合物分子与靶标蛋白的55个结合位点在Cerius2的LigandFit模块下进行对接。对接之前，首先需对靶标蛋白进行预处理，然后去除原配体，保存。去除原配体也须处理后保存。对接中使用柔性对接，另外将Pose Saving Strategy下的参数Max number of pose saved改为1，其余参数均为默认设置。保存为合适的名字，点击Ligand Fit下的Dock Ligands按钮进行对接。对接完成后，还需要进行原配体与靶标蛋白的对接，与上述步骤相同。构建小分子-靶标网络图

经过LigandFit对接，我们可以得到672个小分子化合物与靶标蛋白的55个位点对接的DockScore值，取得分前四十的小分子和靶标利用Pajek软件构建小分子-靶标蛋白相互作用的D-T网络图。最后，使用软件CentiBin计算其Degree值。

通过网络图可以直观的看到多个化合物分子分别靶向多个不同的靶标蛋白，表明中药的作用机理是多靶点相互协同作用，进一步揭示了中药复杂的作用机制。

2 活性化合物分子与靶标的精细对接

活性化合物与靶标的精细对接在Autodock软件中完成。采用拉马克遗传算法（Lamarckian GA）以及半经验自由能的方法分别来寻找和评价配体和受体间相互作用的最佳结合位置及匹配情况，通过分子精细对接得到的结合能和最佳构象在受体中的位置，为新药的研发与设计提供更精确的数据。

2.1 配体的筛选

由于Autodock对接不像LigandFit对接可以批量处理，只能逐个进行对接，因此在初步选出的11个化合物小分子中，选出Degree较大的6个化合物分子做精细对接的配体。他们分别是T56、H1、C71、D67、D14、H17。

2.2 受体的选择

由于检索到的与心血管疾病相关的靶标较多，若在Autodock软件中一一做精细对接工作量相对较大，因此根据化合物分子和靶标蛋白质的LigandFit对接筛选出的活性成分，在这30个靶标蛋白中找出与上述11个活性化合物分子结合较好的部分靶标蛋白作为精细对接的受体，如1TVO、1ALU等。

2.3 精细对接

首先是受体分子的准备，将切除原配体的蛋白靶标三维结构导入AutoDock中，去掉溶剂并加极性氢和点电荷。其次是配体小分子的准备，将已经优化好的6个小分子也导入Autodock中，转换格式并保存。接下来选择Grid选项卡计算格点亲和力，输入受体和配体分子，并设定格点参数，number of points in x-dimension，number of points y-dimension，number of z-dimension均为60，Spacing为0.375，以受体分子作为中心，然后在选项卡下选择运行Run Autogrid；待Autogrid运行完毕后便是AutoDock的对接了，设定好配体和受体及相应的参数，选择拉马克算法进行分子对接，得到一个DLG文件。

2.4 对接的结果

以选出的6个活性化合物分子与靶标蛋白1ALU的精细对接结果为例进行讨论。主要根据受体与配体的键合自由能、抑制常数等参数来分析受体与配体的结合情况，对接自由能=分子间能（vdw + Hbond + desolv energy）+旋转能+总内能-其他能量

注：对接自由能=Free Energy of Binding；静电能=Electrostatic Energy 分子间能量=Final Intermolecular Energy ；旋转能=Torsional Free Energy 总内能=Final Total Internal Energy ； 非键系统能=Unbound System&apos；s Energy

当结合自由能（BE）的绝对值较大而抑制常数偏小时，说明受体与配体之间结合较好。H17的结合自由能最大且抑制常数较小，所以H17与该受体的对接为最佳对接。因此舍弃其他5个分子，仅对上述H17分子做进一步研究。

如图2所示，H17的结构经过一定程度的旋转和折叠之后，刚好嵌入1ALU的环形口袋，二者具有很高的契合度，H17与1ALU上的残基LYS86、GLU93、LEU64、ASN63、LEU62 等具有明显的相互作用；苯环骨架上的羟基和残基上的羰基发生了分子间氢键作用，可见这个位置上如果有活性氢则有助于配体与受体之间的结合，同时酯基上的羰基与残基上的N-H发生了氢键作用[10]，说明在该位置如果有C=O等易生成氢键的基团时则有助于配体与受体之间的结合，通过键能比较发现，苯环上的羟基对二者的相互作用影响最大。

3 结论

通过桃仁红花煎中已知的672个化合物分子与心血管疾病有关的30个靶标蛋白的55个活性位点的对接，虚拟筛选出11个生物活性较高的成分，这些化合物可以作为开发治疗心血管疾病药物的先导化合物。利用对接结果構建了小分子-靶标蛋白相互作用网络图，证实了桃仁红花煎中所含的化合物分子具有多靶点相互协同作用。接下来选取活性较高的6个分子与部分靶标蛋白做了进一步的精细对接，获得了活性小分子与靶标蛋白相互作用的定量数据，揭示了桃仁红花煎在治疗心血管疾病方面的作用机理，对筛选出的治疗心血管疾病的活性小分子的结构改造，新药设计和开发提供了详 细信息和指导。

参考文献

[1]王仁芳，范令刚，高文远，等.桃仁化学成分与药理活性研究进展[J].现代药物与临床：2010，25（6）：426-429

[2]张金涛，于敏佳.丹参化学成分及其临床应用探讨[J].黑龙江科技信息：2011，15（18）：44-44

[3]刘俊峰，张建伟.桃仁红花煎加减治疗脑血管性痴呆 40 例[J].陕西中医：2007，28（2）：147-148