理气化痰活血方药对大鼠冠脉微血管血栓形成及阻塞的影响

王贤良，苏立硕，毛静远，王　帅，赵国元，王　聪

天津中医药大学第一附属医院心血管科，天津 300193



·论著·

理气化痰活血方药对大鼠冠脉微血管血栓形成及阻塞的影响

王贤良，苏立硕，毛静远，王帅，赵国元，王聪

天津中医药大学第一附属医院心血管科，天津 300193

摘要：目的复制大鼠冠脉微血管血栓形成的动物模型，考察理气化痰活血方药对大鼠冠脉微血管血栓形成及血栓阻塞的影响。方法将清洁级健康雄性SD大鼠125只[体重为(300±25)g]顺序编号，采用抽签法随机分为治疗组(n=60)、对照组(n=60)及空白组(n=5)3组，治疗组和对照组大鼠均通过经心尖部向左心室内注射月桂酸钠建立大鼠冠脉微血管血栓形成动物模型，治疗组术前1 d及术后给予理气化痰活血方药灌胃(1 ml/100 g，每日1次)，对照组术前1 d及术后给予蒸馏水灌胃(1 ml/100 g，每日1次)，两组分别在术后1、24 h，7、14、21、28 d各时间点随机处死5只大鼠，并留取心肌组织；空白组5只大鼠不予任何处理，正常饲养，在28 d时一并处死，留取心肌组织。心肌组织标本经HE染色制作病理切片，观察比较各组大鼠各时间点冠脉微血管血栓形成及微血管血栓阻塞情况。结果治疗组和对照组大鼠经心尖部注射月桂酸钠后1 h即有冠脉微血管血栓形成，24 h左右血栓形成率最高；与空白组比较，治疗组和对照组冠脉微血管均出现不同程度的阻塞情况。治疗组术后各时间点冠脉微血管血栓形成率均明显低于对照组(P<0.05或P<0.01)；治疗组冠脉微血管血栓阻塞程度明显轻于对照组(P<0.05或P<0.01)。结论通过注射月桂酸钠可以成功诱导大鼠冠脉微血管血栓形成。理气化痰活血方药可减少大鼠冠脉微血管血栓形成，同时可改善大鼠冠脉微血管血栓阻塞程度。

关键词：冠脉微循环；理气化痰活血方药；微血管血栓形成；微血管阻塞

ActaAcadMedSin，2016,38(3)：260-264

随着心脏介入诊疗技术的广泛开展，冠脉微循环障碍越来越引起人们的关注，临床上冠脉微循环障碍常见于心脏X综合征(cardiac syndrome X，CSX)、冠脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)术后无复流、高血压和糖尿病导致的冠脉微血管病变等，在所有与冠脉微循环障碍相关的心脏疾病中，CSX最具代表性。现代医学的治疗主要是承袭冠心病用药，临床效果并不令人十分满意，而中医药在改善临床症状甚者预后方面显示出独特优势。前期研究发现，气滞痰阻血瘀是CSX的主要病机特征[1]，理气化痰活血方药可有效缓解CSX患者心绞痛症状，提高运动耐量[2]。本研究通过经心尖部向左心室内注射月桂酸钠复制大鼠冠脉微血管血栓形成动物模型，模拟临床患者发作心绞痛而大冠脉无有意义狭窄的情况，评估了理气化痰活血方药对大鼠冠脉微血管血栓形成及血栓阻塞的影响。

材料和方法

实验动物清洁级健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠125只，体重(300±25) g，购自中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物实验中心[许可证号：SCXK(军)2014- 0001]。

实验药物理气化痰活血方药主要组成：柴胡、枳壳、瓜蒌皮、薤白、云苓、白术、陈皮、川芎、当归、丹参、延胡索、红花等。饮片购于天津中医药大学第一附属医院药剂科，由天津市石天药业有限责任公司加工成2.25 g/ml的浓缩剂。

实验试剂及仪器水合氯醛(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、月桂酸钠粉剂(天津市百世化工有限公司)、利多卡因注射液(东北制药集团沈阳第一制药厂)、肝素钠注射液(常州千红生化制药股份有限公司)、40万U青霉素粉针剂(石家庄石药集团中诺药业有限公司)、10%中性福尔马林溶液(上海麦克林生化科技有限公司)、10%氯化钾注射液(武汉滨湖双鹤药业有限责任公司)，小动物体重台称(上海花潮电器有限公司)，BP310S电子天平(德国Sartorius公司)，小动物呼吸机(ALC-V8型动物呼吸机,上海奥尔科特生物科技有限公司)，Olympus光学显微镜及图像观察系统(日本Olympus仪器有限公司)。

动物分组及给药将大鼠称重编号后，采用抽签法随机分为治疗组(n=60)、对照组(n=60)及空白组(n=5) 3组，观察性饲养7 d。治疗组术前1 d及术后给予理气化痰活血方药(1 ml/100 g)灌胃，每天定时1次；对照组术前1 d及术后给予蒸馏水(1 ml/100 g)灌胃，每天定时1次；空白组每天予蒸馏水(1 ml/100 g)灌胃，每天定时1次。

模型制作大鼠称重并予10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉，将大鼠取仰卧位固定，常规颈部及胸部备皮消毒，颈部正中切开皮肤钝性分离暴露气管，直视下经气管插管，连接小动物呼吸机辅助通气，于左侧第2肋间水平靠近胸骨左缘纵向切开肌肉，依次剪断第2肋、第3肋、第4肋，寻找并暴露主动脉，用自制扩胸器向左右两侧扩张胸腔，使心尖部位暴露，使用一次性0.1 ml注射器由心尖部刺入左心室腔内，迅速注入月桂酸钠1 ml/kg(浓度1 mg/ml)，同时夹闭主动脉升部与主动脉弓连接处10 s，以使注入的月桂酸钠试剂顺利进入冠状动脉。注射完成后迅速将心脏放入胸腔，待心跳平稳后缝合肋骨和胸骨，关闭胸腔，逐层缝合肌肉、皮下组织和皮肤，待呼吸平稳后拔除气管插管。术中或术后出现心脏骤停或者呼吸停止，给予胸外心脏按压。术后常规给予青霉素80万U腹腔注射预防感染，连续注射3 d，待大鼠完全苏醒后送回鼠笼饲养。

标本采集及观察每组大鼠于实验终点时沿心脏长轴取约2 mm厚心肌组织，置于10%中性甲醛液保存，行HE染色。视野(×100)下随机观察10根管壁直径<100 μm的冠脉微血管，观察冠脉微血管内血栓情况及冠脉微血管阻塞情况，计数被栓塞的血管数量，并计算其占所观察的微血管的百分率，观察冠脉微血管血栓阻塞程度，冠脉微血管血栓栓塞程度分为：(1)轻度：微血管阻塞<30%；(2)中度：微血管阻塞30%～70%；(3)重度：微血管严重阻塞70%～100%。

统计学处理采用Excel 2007和SPSS 13.0统计软件，所得数据以均数±标准差表示，单变量计量资料样本均数间比较，若符合正态分布采用单因素方差分析；多重比较用LSD或SNK法，若方差不齐，则用Games-Howell分析；组间两两比较采用t检验，个别不符合正态分布数据则釆用非参数检验；P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一般情况对照组60只大鼠中，术中死亡16只，造模成功后死亡11只；治疗组60只大鼠中，术中死亡14只，造模成功后死亡8只；两组间差异无统计学意义(P>0.05)。

大鼠冠脉微血管原位血栓形成情况HE染色结果显示，对照组和治疗组大鼠冠脉微血管均可见白色或混合血栓形成，空白组大鼠冠脉微血管内未见明显血栓形成 (图1)。

理气化痰活血方药对大鼠冠脉微血管血栓形成的影响治疗组大鼠术后各时间点冠脉微血管血栓形成率均明显低于对照组(P<0.05或P<0.01) (表1)。

理气化痰活血方药对冠脉微血管血栓阻塞程度的影响对照组各时间点冠脉微血管阻塞程度均较治疗组明显严重，对照组冠脉微血管阻塞重度和中度阻塞所占比重大，治疗组冠脉微血管阻塞轻度阻塞所占比重较多，差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)(表2～4，图2)。

A.对照组；B.治疗组；C.空白组

A. control group；B. treatment group；C. blank group

图 13组大鼠冠脉微血管形成情况(HE，×200)

Fig 1Coronary microvessles in three groups(HE，×200)

表 1　3组大鼠术后各时间点冠脉微血管血栓率(x-±s，%)

与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01

aP<0.05，bP<0.01 compared with control group

表 2　对照组和治疗组大鼠术后各时间点冠脉微血管轻度阻塞情况的比较(n=30，x-±s，%)

表 3　对照组和治疗组大鼠术后各时间点冠脉微血管中度阻塞情况的比较(n=30，x-±s，%)

表 4　对照组和治疗组大鼠术后各时间点冠脉微血管重度阻塞情况的比较(n=30，x-±s，%)

A. 轻度阻塞(×200)；B. 中度阻塞(×200)；C. 重度阻塞(×400)

A. mild obstruction (×200)；B. moderate obstruction (×200)；C. severe obstruction (×400)

图 2大鼠冠脉微血管阻塞情况(HE)

Fig 2Coronary microvascular obstruction in rats(HE)

讨论

冠脉微循环由冠状动脉微血管组成，冠状动脉微血管指直径<150 μm的血管(包括细动脉、毛细血管、细静脉等)，冠脉微循环的完整和畅通是心肌灌注的重要保障。随着冠脉微循环障碍检测技术的不断提高及其评估体系的日臻完善，冠脉微循环障碍所引起的临床表现及其对心脏疾病诊断、治疗及预后的影响日渐受到重视。冠脉微血管血栓形成、心外膜血管斑块破溃脱落进入微循环等，都可能导致冠脉微循环障碍，其中冠脉微血管内形成的原位血栓是造成冠脉微循环障碍的常见原因[3]。目前建立冠脉微循环障碍动物模型的常见方法中，本研究采用的化学损伤法最符合临床冠脉微循环障碍的发病机制和特点[4- 5]。

冠脉微循环障碍以胸闷、胸痛为主要临床表现，相当于中医“胸痹”、“心痛病”范畴。本课题组前期研究结果显示，CSX发病的关键因素在于气滞、痰阻、血瘀，三者相互影响、相互转化痹阻心脉[1],并证实了理气化痰活血方药在改善CSX患者临床症状及中医证候、保护血管内皮等方面的效果[2]。方中柴胡、积壳、瓜萎皮、薤白解郁理气宽胸，为君药；川芎、当归、丹参、延胡索、红花行气活血止痛，为臣药；佐以茯苓、白术、陈皮健脾化痰。诸药相伍，理气而不伤气，化痰而不刚燥，活血而不损血，共奏理气化痰活血之功。现代中药药理研究结果表明，柴胡皂苷可以减少冠脉微血管中白细胞的附着，减轻炎症反应[5]；枳壳、陈皮、延胡索药理研究表明可以增加冠脉流量，降低心肌氧耗量[6- 7]；薤白、当归、川芎、丹参、红花药理研究表明，能显著延长小鼠凝血时间，有抑制凝血和抗血栓形成的作用[8- 11]。本研究结果则显示，理气化痰活血方药可以有效减少冠脉微血管血栓形成，降低冠脉微血管血栓阻塞程度，其可能作用机制尚待进一步探讨。

参考文献

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基金项目：国家自然科学基金(81202799)和教育部“创新团队发展计划”(IRT1276)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China (81202799) and the Ministry of Education of People’s Republic of China“Program for Innovative Research Team in University”(IRT1276)

通信作者：毛静远电话：022- 27986008，电子邮件：jymao@126.com

中图分类号:R256.22

文献标志码:A

文章编号：1000- 503X(2016)03- 0260- 05

DOI：10.3881/j.issn.1000- 503X.2016.03.003

Corresponding author：MAO Jing-yuanTel：022- 27986008，E-mail：jymao@126.com

(收稿日期：2015- 07- 02)

Effect of Qi-regulating，Phlegm-resolving，and Blood-promoting Prescription on Rat Coronary Microvascular Thrombosis and Coronary Microvascular Occlusion

WANG Xian-liang，SU Li-shuo，MAO Jing-yuan，WANG Shuai，ZHAO Guo-yuan，WANG Cong

Department of Cardiology，First Teaching Hospital of Tianjin University of TCM，Tianjin 300193，China

ABSTRACT：ObjectiveTo explore the effect of qi-regulating，phlegm-resolving，and blood-promoting prescription on coronary microvascular thrombosis and coronary microvascular occlusion in rat models. MethodsTotally 125 healthy clean-grade male SD rats weighing (300±25) g were sequentially numbered and then randomly divided into treatment group (n=60)，control group (n=60) and blank group (n=5).Rats in the treatment group and control group received apical left ventricular injection of sodium laurate to establish rat models of coronary microvascular thrombosis. Then，rats in the control group were given distilled water by gavage one day before operation and after surgery. In contrast，rats in the treatment group were given qi-regulating，phlegm-resolving，and blood-promoting prescription by gavage one day before operation and after surgery. Five rats from both treatment group and control group were killed at each of six time points (1 hour，24th hour，7th day，14th day，21th day，and 28th day)，and the myocardium specimens were harvested. The 5 rats in the blank group did not receive any special treatment and were given normal feeding；in the 28th day，they were sacrificed to obtain the myocardial specimens. Pathological sections of rat myocardial tissues were made to observe and compare the degrees of coronary microvascular thrombosis and coronary microvascular obstruction. ResultsIn the treatment group and the control group，coronary microvascular thrombosis occurred 1 hour after apical sodium laurate injection and reached the peak at the 24th hour. Compared with the blank group，the treatment group and the control group showed different degree of coronary microvascular obstruction. Comparison between the treatment group and the control group at each time point showed that the coronary microvascular thrombosis in the treatment group was significantly lower than that in the control group (P<0.05 or P<0.01).The severity of coronary microvascular occlusion was significantly milder in the treatment group than in the control group (P<0.05 or P<0.01). ConclusionsApical left ventricular injection of sodium laurate successfully established rat models of coronary microvascular thrombosis. Qi-regulating，phlegm-resolving，and blood-promoting prescription can reduce coronary microvascular thrombosis and improve coronary microvascular obstruction.

Key words：coronary microcirculation；qi-regulating,phlegm-resolving,and blood-promoting prescription；coronary microvascular thrombosis；coronary microcirculation disturbance