结核杆菌三种实验方法的应用评估

陈杏媛，郭琴华

(吉安市中心人民医院，江西　吉安343000)



·检验与临床·

结核杆菌三种实验方法的应用评估

陈杏媛，郭琴华

(吉安市中心人民医院，江西吉安343000)

摘要：目的比较痰涂片法、实时荧光定量PCR法和免疫结核抗体（金标法）检测对结核病的诊断意义。方法选取2015年7月至2015年10月在我院诊疗疑似或确诊患者172例，进行涂片抗酸染色、实时荧光定量PCR法检测和采集血样进行免疫结核抗体检测。结果172例检测样本中，抗酸染色痰液标本阳性例数只有20例，阳性率为11.6%。实时荧光定量PCR法阳性例数55例，阳性率31.2%。免疫结核抗体（金标法）阳性例数为87例，阳性率为50.6%。结论三种方法中，以结核抗体阳性率最高，实时荧光定量PCR法次之，抗酸染色法阳性率最低。如果三种方法联合运用，相互佐证，可提高准确性。

关键词：结核杆菌；检测方法

结核杆菌是引起结核病的病原菌，可侵犯全身器官，但以肺结核为多见。结核病至今仍为重要的传染病，据WTO报道，每年约有800万新病例发生，约300万人死于该病。近年来，因艾滋病、吸毒等社会原因及免疫制剂的应用，其发病率呈上升趋势[1]，在我国一些地区结核病已在感染性长期发热的病因中上升至首位[2，3]。当前，对结核病的预防、诊断以及临床治疗已经成为我国重点解决的医学课题[4]。通过早诊断、早治疗，绝大多数的结核病患者均可以治愈[5]。长期以来，结核病的实验室诊断是结核病防治的重点和难点[6]。鉴定结核杆菌的方法有很多，但各种方法的特异性和敏感性各不相同。本人对痰涂片染色法、实时荧光定量PCR法、免疫结核抗体（金标法）3种方法进行对比研究，以评价各种方法的优缺点和对临床的应用价值。

1　材料与方法

1．1材料收集自2015年7月至2015年10月期间在我院诊疗疑似或确诊结核病的患者标本172例。涂片法和实时荧光定量PCR法的标本为痰液。嘱患者留取晨痰2~5ml (结核患者需停抗结核药3天）结核抗体检测则采静脉血2ml。

1.2检测方法

1.2.1涂片染色镜检是临床常用的简易快速的检查方法：取痰或其他已处理好的标本0.1ml，于载玻片上均匀涂抹成2cm×2.5cm椭圆形范围，以自然干燥和火焰固定后，进行抗酸染色，采用珠海贝索生物技术有限公司的结核染色液。染色步骤：⑴石碳酸复红溶液染色20min；⑵5%盐酸酒精脱色3min；⑶亚甲基蓝溶液染色30s。

1.2.2实时荧光定量PCR法（试剂盒为中山大学达安基因公司产品）⑴取患者咳出的深部痰，痰液中加入4倍体积4%NaOH液化痰液，30min后吸1.5ml置EP内。⑵在金属浴内100℃（3~5min）12000r/min，弃上清液。⑶加入生理盐水约1.5ml混匀振荡，离心弃上清液。⑷重复洗涤1次。⑸加入40μl DNA提取液在金属浴100℃10min。⑹12000r/ min离心5min标本处理完毕。⑺离心取上清2μl 至PCR反应管内，反应管置定量PCR扩增仪内，按以下条件进行扩增：93℃2min预变性，93℃ ations in cardiovascular diseases：life style intervention [J]. Biomed Res Int，2014：801896. doi.10.1155/2014/801896.

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1.2.3免疫结核分枝杆菌抗体检测（金标法）细菌在体内生长繁殖产生的代谢产物，刺激机体免疫系统产生特异性抗体，包括IgA、IgE、IgM、IgG，检测这些抗体可帮助诊断分枝杆菌感染。将结核分枝杆菌特异性膜蛋白抗原分离纯化，点样并固化在硝酸纤维膜上。膜上TB抗原捕获人血清样品中结核分枝杆菌抗体，被捕获的结核IgG抗体可用葡萄球菌A蛋白（SPA）能与IgG特异性结合），形成红色斑点，根据是否出现红色斑点即可判断阴、阳性结果从而判断是否存在结核分枝杆菌抗体标本要求必须使用新鲜的血清标本。血浆标本必须用玻璃剥离纤维蛋白，保证血清无混浊沉淀，以免吸入导致反应膜孔阻塞（试剂为上海奥普生物医药有限公司提供）。

1.3统计学分析运用SPSS 14.0软件采用t检验进行统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

结核杆菌3种检测方法结果比较：3种方法中，免疫结核抗体（金标法）阳性率最高，达50.6%。其次为实时荧光定量PCR法，阳性率为32.2%。阳性率最低为痰涂片法，阳性率仅为11.6%。三种检测方法比较，阳性率差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1　3种检测方法的结果

3　讨论

对于肺结核的实验室诊断，痰涂片法是检测抗酸杆菌最普遍使用的方法，具有快速、简便、经济、特异性高，但阳性率低，无法满足对结核病的诊断需求[7]。实时荧光定量PCR法可在1d内完成临床样品处理、核酸提取和检测全过程，具有反应快速、特异性好、灵敏度高等许多优点。通过比较，实时荧光定量PCR法和传统的涂片法，两者有较好的一致性；在不选择病例的前提下，前者的阳性率比后者高3倍左右。而且定量PCR是在完全封闭状态下实现PCR扩增和产物分析，完全杜绝了扩增产生污染而导致假阳性，结果真实可靠[8，9]。但该方法相对价格稍高，需较为昂贵的仪器和设施。免疫结核抗体检测（金标法）是一种简单、快速的检测方法，且阳性率较高（50.6%）。而且试剂和样品用量极少，无需仪器设备，简化了繁琐的常规操作过程，同时也减小了因操作引起的误差。免疫结核抗体检测（金标法）简便、快速、适应单人份测定的特点，尤其适用于基层医院。但是其灵敏度稍低，有一定的假阳性和假阴性，特异性稍差，结果判断带有一定的主观性，缺乏有效的质控手段，其灵敏度和敏感性均有待提高[10]。如果三种方法联合运用，相互佐证，尤其对临床医师高度怀疑为结核的病例，当用一种检测方法为阴性时，就应采用其它两种方法重新检测，从而使结核患者的检测准确性得以明显提高，多方面满足临床需要，提高肺结核的诊断水平。

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中图分类号：R446.19，R825.2，R378.91+2

文献标识码：A

文章编号：1674-1129(2016)03-0373-02

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.03.036

(收稿日期2016-01-11；修回日期2016-03-11)45s→55℃60s10个循环，93℃30s→55℃45s30个循环。扩增过程中仪器实时检测荧光强度并分析增长曲线，根据Ct计算出样本中DNA含量（基因拷贝数/ml）。阳性判断标准为：增长曲线呈S型，最强荧光值增高20单位以上。 2016-03-14；修回日期2016-04-17)