不同产地黄芪总黄酮HPLC指纹图谱研究

陈伯丛王汝上罗德祥（.广东省佛山市中医院　佛山　528000；2.广州康臣药物研究有限公司　广州　50530）

不同产地黄芪总黄酮HPLC指纹图谱研究

陈伯丛1王汝上2*罗德祥1（1.广东省佛山市中医院佛山528000；2.广州康臣药物研究有限公司广州510530）

摘要：目的：建立黄芪总黄酮的HPLC指纹图谱分析方法，评价不同来源药材的质量。方法：采用二极管阵列检测器，色谱柱为AglientExtend C18（250mm×4.6mm，5μm），流动相为乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B），梯度洗脱，流速为1.0mL/min，检测波长为280nm。结果：建立14个共有特征峰的HPLC指纹图谱，方法学考察结果符合指纹图谱技术要求。结论：该方法稳定可靠、重复性好，可结合含量测定用于全面控制黄芪的质量。

关键词：黄芪 总黄酮 高效液相色谱 指纹图谱

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge的干燥根，春、秋二季采挖，除去须根及根头，晒干，具有补气固表、利尿脱毒、排脓、敛疮生肌的作用，临床用于气虚乏力、食少便溏、中气下陷、久泻脱肛、便血崩漏、表虚自汗、气虚水肿、痈疽难溃、久溃不敛、血虚痿黄、内热消渴、慢性肾炎蛋白尿、糖尿病等症［1］。黄芪在我国分布广泛，主要分布于内蒙古、山西、甘肃、陕西等地。研究表明，黄芪主要化学成分有黄酮（毛蕊异黄酮、芒柄花素及其糖苷等）、皂苷（黄芪皂苷、异黄芪皂苷、乙酰基黄芪皂苷及大豆皂苷Ⅳ）及多糖等，具有以下药理及临床应用：黄酮能通过抑制内皮细胞氧化应激损伤、凋亡和炎症，保护血管内皮免受糖尿病损伤；多糖具有降血糖、免疫调节、治疗代谢紊乱等作用，能改善糖尿病肾病症状；黄芪皂苷具有降血糖、降血脂、免疫调节、防治心肌损伤等作用，能抑制糖尿病患者视网膜病变、神经病变的进程，对糖尿病并发症有预防作用［2～6］。

不同产地的黄芪之间的总黄酮含量相差较大，目前对黄芪质量控制较为单一，无法全面反映黄芪药材质量。本研究采用HPLC法对不同产地的黄芪进行指纹图谱研究，并建立方法，为全面、有效控制黄芪药材质量提供科学依据。

1仪器与试药

1.1仪器：Agilent 1260液相色谱仪（DAD检测器）；超纯水系统（Millipore公司）；电子天平（Sartorius，BT-25S）；中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）

1.2材料：乙腈（色谱纯，Merck），水为超纯水，其他试剂为分析纯。黄芪对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：120974-201311）；黄芪药材采于产地或购于药材市场，详见表1。

2方法

2.1供试品溶液的制备：取黄芪药材2.5g，精密称定，加入40mL 的70%乙醇回流提取1次，每次3h，滤过，加70%乙醇定容至100mL，经微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2对照品溶液的制备：取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品10mg，精密称定，置于50mL容量瓶中，用色谱甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。

2.3色谱条件：色谱柱：AglientExtend C18（250mm×4.6mm，5μm）。流动相：乙腈-0.2%甲酸水溶液，梯度洗脱，见表2。

表1药材来源

表2梯度洗脱

检测波长：280nm。

流速：1.0mL/min。

柱温：30℃。

进样量：10μL。

2.4流动相考察：研究过程中，考察了不同浓度的乙腈-甲酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液、甲醇-甲酸水溶液、甲醇-磷酸水溶液等不同体系的梯度洗脱系统。结果表明，以乙腈-0.2%甲酸水溶液梯度洗脱分离效果最好，特征峰明显。因此，本研究选择乙腈-0.2%甲酸水溶液作为流动相，梯度洗脱，分析时间为60min。2.5检测波长考察：吸取上述供试品溶液适量，以色谱条件分析，利用DAD检测品经过190～400nm全波长扫描，大多数成分在波长280nm处有较大吸收，主要色谱峰分离较好，基线平稳，故确定280nm为检测波长。

2.6参照物考察及共有峰标定：根据以上方法对16批黄芪药材指纹图谱进行分析，结合相似度结果，标定14个共有峰，以峰4（毛蕊异黄酮葡萄糖苷）为参照峰，见图1。

2.7测定方法：分别精密取对照品溶液和各样品溶液10μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷的色谱峰的保留时间及峰面积为t计算其他峰的相对保留时间及相对峰面积。

3方法学考察

3.1精密度试验：取同一批黄芪药材（S9，产地山西浑源）供试品溶液，连续进样6次，考察峰面积的精密度，结果表明仪器和系统的精密度良好，见表3。

表3精密度相似度试验结果

3.2稳定性试验：取同一批黄芪药材（S9，产地山西浑源）供试品溶液，于配制后0、2、4、8、12、24、36、48 h进样测定，结果表明48h内稳定，见表4。

表4稳定性相似度试验结果

3.3重复性试验：取同一批黄芪药材（S9，产地山西浑源）6份，分别制备成供试品溶液，测定，记录峰面积，结果表明重复性良好，见表5。

表5重复性相似度试验结果

4不同产地药材考察结果分析

4.1相似度分析：指纹图谱的相似度是指纹图谱的整体相关性，它把指纹图谱的重叠率和共有峰的峰强度结合起来。本部分根据上述方法对16批黄芪药材指纹图谱进行相似度分析，数据处理采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版（2004A）计算，结果见表6。

表6不同产地药材相似度结果

结果显示，16批黄芪药材相似度差异较大，其中S3、S4、S5、S8、S9、S11、S12、S15和S16均大于0.9。

4.2相对保留时间和相对峰面积：取黄芪药材16批，按上述方法进行检测，得出16批样品的HPLC图谱，见图2，计算相对保留时间及相对峰面积，求出RSD值，其中14个共有特征峰的相对保留时间RSD值均小于1.0%，相对峰面积RSD值为34.675%～189.408%，总峰面积大于均值的有S9、S10、S12、S13、S15、S16，结果见表7、8。

表7 16批黄芪相对保留时间

表8 16批黄芪相对峰面积

结果显示，不同产地黄芪药材样品间相对保留时间差异较小，相对峰面积差异较大。因此，选择相似度大于0.9的产地药材，即S9、S11、S12、S13、S15和S16，产地分别为山西浑源、山西浑源、山西应县、陕西子洲、内蒙古和对照药材，作为日后研究与生产的备选药材。

5讨论

以单一的有效成分控制中药质量已不能适应中药现代化的形势，中药指纹图谱可以在不清楚全体化学成分的情况下，有效控制中药的内在质量，提高中药质量的稳定性［7］。本研究采用HPLC建立黄芪药材总黄酮指纹图谱分析方法，经方法学考察和16批样品的测定分析，结果显示，该方法稳定、可靠、专属性强、重复性好，可作为筛选黄芪药材及质量控制参考，提高质量控制水平。

本研究曾考察水、70%乙醇、70%甲醇等为提取溶剂提取黄芪药材中总黄酮成分的工艺进行薄层色谱鉴定的定性考察，结果显示以水为提取溶剂的薄层色谱图比以乙醇和甲醇为提取溶剂的薄层色谱图在相同位置上的斑点少，而以乙醇和甲醇为提取溶剂的薄层色谱有相同的斑点数，相同斑点的位置一致，斑点大小和颜色一致，即以水为提取溶剂提取得到黄芪药材的成分较少。故提取溶剂选择乙醇或甲醇。考虑环保、成本与安全性，最终选择乙醇作为黄芪的提取溶剂。

本研究采用HPLC指纹图谱应用于黄芪药材的鉴定与质量评价，能更有效评价药材的质量；通过使用中药材指纹图谱相似度评价软件进行相似度评价，为指纹图谱研究成果运用于中药材生产和市场流通的质量分析提供一个新方法，对科研和生产实践具有重要指导意义。

参考文献

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典［S］.一部.中国医药科技出版社，2015：302-303.

［2］张蔷，高文远，满淑丽.黄芪中有效成分药理活性的研究进展［J］.中国中药杂志，2012，37（21）：3203-3207.

［3］Xu YH，Xiong J，Wang SS，Tang D，Wang RS，Zhu Q.Calycosin entered HUVECs and ameliorated AGEs-promoted cell apoptosis via the Bcl-2 pathway.J Nat Med.2014 Jan；68（1）：163-172.

［4］Xu Y，Feng L，Wang S，Zhu Q，Zheng Z，Xiang P，He B，Tang D.Calycosin protects HUVECs from advanced glycation end products-induced macrophage infiltration.J Ethnopharmacol.2011 Sep 1；137（1）：359-370.

［5］Xu Y，Feng L，Wang S，Zhu Q，Lin J，Lou C，Xiang P，He B，Zheng ZG，Tang D，Zuo G.Phytoestrogen Calycosis-7-O-β-D-Glucopyranoside Ameliorates Advanced Glycation End Products-Induced HUVEC Damage.Journal of Cellular Biochemistry. 2011 June；112：2953-2965.

［6］Tang D，He B，Zheng ZG，Wang RS，Gu F，Duan TT，Cheng HQ，Zhu Q.Inhibitory effects of two major isoflavonoids in Radix Astragali on high glucose-induced mesangial cells proliferation and AGEs-induced endothelial cells apoptosis.Planta Med.2011 May；77（7）：729-732.

［7］黄晓玲，朱荃，郑兆广，等.尿毒清颗粒HPLC指纹图谱研究［J］.中国中医药信息杂志，2013，20（6）：45-47.

中图分类号：R284

文献标识码：A

文章编号：1672-8351（2016）07-0008-03

*通讯作者

HPLC fingerprinting of Flavonoids in Radix astragali

Cheng Bocong1Wang Rushang2*Luo Dexiang1（1.Foshan Hospital of TCM，Guang Dong，Fo Shan，528000；2.Guangzhou Consun Drug Research Ltd.，Guang Dong，Guang Zhou，510663）

Abstract：Objective：To study and to establish the HPLC fingerprint of Flavonoids in Radix astragali，and estimate the quality of Radix astragali in various species from different habitats.Methods：The method adopts DAD detector，AglientExtend C18（250mm×4.6mm，5μm）column，mobile phase was acetonitrile（A）-0.2%formic acid aqueous solution（B），with gradient elute.The flow rate was 1.0 mL/min，detection wavelength was 280 nm.Results：We established 14 characteristic peaks of HPLC fingerprint，the results of method validation met technical standard of fingerprints.Conclusion：The method is stable and reliable with a good reproducibility and to be used to control its quality with combination assaying.

Key words:Radix astragali Flavonoids HPLC Fingerprints