祛风通络方对阿霉素肾病大鼠肾小球内皮细胞通透性的影响

王　娟，　崔志军，　马巧亚，　孙万森，　王　竹

(1.西安交通大学医学院第二附属医院，　陕西　西安　710004 2.陕西省交通医院急诊科，　陕西　西安　710068)



祛风通络方对阿霉素肾病大鼠肾小球内皮细胞通透性的影响

王娟1，崔志军2，马巧亚1，孙万森1，王竹1

(1.西安交通大学医学院第二附属医院，陕西西安710004 2.陕西省交通医院急诊科，陕西西安710068)

【摘要】目的：探讨祛风通络方对阿霉素肾病大鼠肾小球内皮细胞通透性的影响。方法：一次性尾静脉注射阿霉素建立大鼠肾病模型。采用全自动生化分析仪检测24h尿蛋白定量、血清生化指标；采用酶联免疫吸附测定试剂盒测定肾小球内皮细胞培养上清血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)水平；采用二室弥散系统检测肾小球内皮细胞通透性。结果：尿蛋白定量降低，血清白蛋白升高，血总胆固醇降低，肾小球内皮细胞培养上清VEGF降低，肾小球内皮细胞通透性降低。结论：祛风通络方可能通过下调阿霉素肾病大鼠肾小球内皮细胞VEGF表达，降低肾小球内皮细胞通透性，从而达到防治蛋白尿的目的。

【关键词】祛风通络方；蛋白尿；肾小球内皮细胞；血管内皮生长因子；通透性

蛋白尿是多种肾脏疾病的主要临床表现之一，蛋白尿程度与肾小球滤过膜通透性密切相关。本课题前期研究证实，祛风通络方可通过调节阿霉素肾病(adriamycin nephropathy，AN)大鼠足细胞相关蛋白表达发挥防治蛋白尿的作用，但祛风通络方对GEC通透性的影响尚未明确[1]。本研究拟以AN大鼠为动物模型，探讨祛风通络方对AN大鼠肾小球内皮细胞通透性的影响，旨在为祛风通络方的临床治疗提供可靠依据。

1材料与方法

1.1动物与药品:SPF级成年雄性SD大鼠48只，体重140g～160g，购于西安交通大学医学院动物实验中心(合格证号为陕医动字第09-005号)；阿霉素购于浙江海正药业，规格：10mg，国药准字H33021980；醋酸泼尼松购于广东华南药业集团有限公司，批号：国药准字H44020682，规格：5mg；祛风通络方由西安交通大学第二附属医院中医科制剂室提供，方中包含黄芪、生地、青风藤、桑寄生、乌梢蛇、海风藤，每剂含生药105g。

1.2实验试剂及仪器:胎牛血清、RPMI1640培养基、PBS缓冲液(Hyclon公司，美国)；血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)ELISA检测试剂盒(R&D公司，美国)；7600-020型全自动生化分析仪(日立公司，日本)；酶标仪(Thermo公司，美国)。

1.3动物模型建立及分组:将48只大鼠按简单随机分组法分为空白对照组(A组，n=8)和肾病模型组(G组，n=40)，参照任艳云[2]等报道方法，采用一次性尾静脉注射阿霉素6mg/kg建立大鼠肾病模型，A组给予尾静脉注射等量生理盐水。3周后检测大鼠24h尿蛋白定量、血清白蛋白(albumin，ALB)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血肌酐(creatinine，Cr)、血总胆固醇(total cholesterol，TC)、血甘油三酯(triglyceride，TG)指标，提示造模成功(见表1)。将G组40只肾病模型大鼠按简单随机分组法分为5组，即B组、C组、D组、E组、F组，每组8只。B组为模型对照组，C、D、E组为祛风通络方干预组，F组为阳性对照组。从第4周期，A组和B组仅给予生理盐水，C、D、E组分别给予含生药量1.0g/mL、2.1g/mL、4.2g/mL的祛风通络方2mL(分别相当于成人临床用药的6倍、12倍、24倍)，F组给予25mg/kg泼尼松液2mL(相当于成人剂量4倍)，各组均采用灌胃给药，1次/d，连续给药28d。实验结束时，处死所有受试动物。

1.4肾小球内皮细胞分离培养:参照曾玉[3]等报道方法，分离培养肾小球内皮细胞。活体取出大鼠肾脏，去除肾被膜及髓质，轻轻碾磨皮质，并依次通过80目、120目、200目筛子，收集肾小球。加入0.1%IV型胶原酶消化肾小球，收集沉淀，将肾小球接种与铺有1%明胶培养瓶，常规培养，待肾小球充分贴壁后常规换液，第3周进行纯化。采用MiniMACS间接免疫磁珠分选系统分离纯化CD34阳性细胞，纯化后细胞常规培养并传代，采用形态学观察、直接免疫荧光法及免疫组化法对所分离内皮细胞进行鉴定。

1.5肾小球内皮细胞通透性测定:参照陈朝红[4]等报道方法，进行肾小球内皮细胞通透性检测。调整内皮细胞浓度为3.0×105个/mL并接种于微孔细胞培养嵌套中，将嵌套置于6孔培养板中，加入1640培养液，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，每天换液一次，待滤膜上内皮细胞生长成致密连接状态后，加入100mg/L biotin-BSA作为通透性指示剂，收集培养12h时内室和外室培养液各10μL，测定biotin-BSA含量。内皮细胞单层对白蛋白的通透性计算公式=(外室biotin-BSA浓度/内室biotin-BSA浓度)×100%。

1.6血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)测定：采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)试剂盒测定肾小球内皮细胞培养上清VEGF水平，操作严格按试剂盒说明书进行。

1.724h尿蛋白测定:采用邻苯三酚红/钼酸盐法检测24h尿蛋白定量。

1.8血清生化指标:采用全自动生化分析仪监测血清ALB、BUN、Cr、TC、TG等指标。

2结果

2.1各组7周末24h尿蛋白定量比较:各组间7周末24h尿蛋白定量比较差异显著(F=20.421，P<0.05)。与B组比较，C、D、E、F组24h尿蛋白定量降低，组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)；C、D、E组三组间24h尿蛋白定量比较无统计学意义(P>0.05)；C、D、E组三组间24h尿蛋白定量与F组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

表1　各组3周末24h尿蛋白定量及血清各项指标比较±s)

注：与A组比较，*P<0.05

表2　各组7周末24h尿蛋白定量比较±s)

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05

2.2各组7周末血清各项指标比较:各组间7周末ALB、Cr、TC、TG比较差异显著(F=15.368、7.213、35.247、44.619，P<0.05)。各组间7周末BUN比较无统计学差异(F=0.734，P>0.05)；与A组相比较，B组ALB明显降低，Cr、TC、TG明显升高，组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。与B组相比较，C、D、E组ALB升高，TC降低，组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。C、D、E组三组间ALB、Cr、TC、TG比较差异无统计学意义(P>0.05)(见表3)。

表3　各组7周末血清各项指标比较±s)

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05

2.3各组肾小球内皮细胞VEGF表达水平比较:各组间7周末肾小球内皮细胞VEGF表达水平比较差异显著(F=14.682，P<0.05)。与A组相比较，B组肾小球内皮细胞VEGF水平明显升高，组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。与B组相比较，C、D、E、F组肾小球内皮细胞VEGF明显降低，组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。C、D、E组三组间肾小球内皮细胞VEGF比较差异无统计学意义(P>0.05)。C、D、E组三组间肾小球内皮细胞VEGF与F组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见图1)。

图1　各组肾小球内皮细胞VEGF表达水平比较示意图

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05

2.4各组肾小球内皮细胞通透性比较:各组间肾小球内皮细胞通透性比较差异显著(F=28.335，P<0.05)。与A组相比较，B组肾小球内皮细胞通透性明显升高，组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。与B组相比较，C、D、E、F组肾小球内皮细胞通透性降低，组间比较差异具有统计学意义(P<0.05)。C、D、E组三组间肾小球内皮细胞通透性比较无统计学意义(P>0.05)。C、D、E组三组间肾小球内皮细胞通透性与F组比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见图2)。

图2　各组肾小球内皮细胞通透性比较示意图

注：与A组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05

3讨论

肾小球内皮细胞作为肾脏滤过屏障的重要组成部分，其通透性增高是诱发蛋白尿的独立危险因素。肾小球内皮细胞通透性改变的机制较为复杂，VEGF的靶向作用是其中的重要机制之一。VEGF作为强大的血管通透因子，主要分布于肾小球足细胞及肾小管上皮细胞中，其在肾脏中的作用机制尚未完全明确，目前认为VEGF可通过旁分泌作用，穿透肾小球基膜，作用于肾小球内皮细胞，从而调节肾小球滤过膜通透性。陈朝红[5]等分别选取肾小球内皮细胞和人脐静脉内皮细胞为研究对象，并观察VEGF体外刺激对二者通透性的影响，结果显示VEGF体外刺激可明显提高肾小球内皮细胞和人脐静脉内皮细胞通透性，且肾小球内皮细胞对VEGF的敏感性明显高于人脐静脉内皮细胞，证实VEGF在肾脏疾病及蛋白尿的发生与发展中发挥重要作用。

本研究采用一次性尾静脉注射阿霉素法成功建立大鼠肾病模型，并在此基础上观察大鼠肾小球内皮细胞VEGF表达及通透性的影响。结果表明祛风通络方和泼尼松对阿霉素肾病大鼠蛋白尿均有明显的治疗作用，且祛风通络方对阿霉素肾病大鼠蛋白尿的治疗作用与泼尼松相当，但并无泼尼松的副作用。不同浓度祛风通络方的干预效果无明显差异。此外，祛风通络方可显著抑制阿霉素肾病所致的肾小球内皮细胞通透性增高，其抑制效果与泼尼松相当，该结果为祛风通络方拮抗阿霉素肾病大鼠蛋白尿提供了可靠佐证。祛风通络方均可明显下调阿霉素肾病所致的VEGF高表达，且各组VEGF变化趋势与肾小球内皮细胞通透性变化趋势相符，提示祛风通络方可能是通过调节VEGF表达达到降低肾小球内皮细胞通透性的目的。

中医认为，脾肾两虚是肾性蛋白尿的主要病机。笔者认为“风伏肾络”是肾性蛋白尿的另一重要病机。本虚乃肾络空虚，标实乃四时邪气。依据此病机，应以“补虚祛邪”之法以填补肾络之空虚，驱逐当令之邪。祛风通络方是在“风伏肾络”病机指导下经多年临床实践加减而成的中药复方。方中以乌梢蛇为君，具有祛风通络、止痉镇痛之功效。现代药理学研究证实，乌梢蛇可明显增强网状内皮系统吞噬能力，对蛋白尿具有较好的治疗效果。海风藤为臣，具有祛风通络、行气止痛之功效。君臣互补，可搜肾络之伏风、通肾络之瘀滞。佐以黄芪、桑寄生，可补肾健脾、利水消肿。纵观全方，共奏祛风通络、补气益肾之功效，契合肾性蛋白尿“风伏肾络”之病机和本虚标实的病性。 综上所述，祛风通络方可能通过下调阿霉素肾病大鼠肾小球内皮细胞VEGF表达，降低肾小球内皮细胞通透性，从而达到防治蛋白尿的目的。

【参考文献】

[1]王竹,刘俊田,孙万森,等.祛风通络方对阿霉素肾病大鼠足细胞Desmin及CD2AP蛋白的影响[J].中国中西医结合杂志,2014,34(2):203～208.

[2]任艳芸,孙万森,赵艳龙,等.祛风通络方对阿霉素肾病大鼠肾小球足细胞nephrinmRNA表达的影响[J].中南大学学报(医学版),2009,34(12):1216～1223.

[3]曾玉,邓红,周晓军,等.大鼠肾小球内皮细胞分离培养和鉴定[J].中华病理学杂志,2005,34(4):233～234.

[4]陈朝红,刘志红,余晨,等.一种体外研究肾小球内皮细胞通透性的方法[J].肾脏病与透析肾移植杂志,2002,11(5):497～500.

[5]陈朝红,刘志红.血管内皮细胞生长因子对肾小球内皮细胞通透性的影响[J].肾脏病与透析肾移植杂志,2002,11(4):353～357.

【基金项目】国家青年自然科学基金，(编号：81001579)；西安交通大学基本科研业务费自由探索与自主创新类项目，(编号：08143035)；西安交通大学医学院第二附属医院院基金重点项目，[编号：YJ(ZD)201203]

【通讯作者】王竹

【文章编号】1006-6233(2016)06-0957-04

【文献标识码】A【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2016.06.028