HPLC-ELSD法测定胆南星中胆酸类成分的含量

蔡宇忆，叶永浩，杨丽莹，黄玉梅，吴志坚，马永德，李书渊



HPLC-ELSD法测定胆南星中胆酸类成分的含量

蔡宇忆1，叶永浩1，杨丽莹1，黄玉梅2，吴志坚2，马永德2，李书渊1

（1.广东药科大学 中药学院，广东 广州 510006；2.广州市药材公司中药饮片厂，广东 广州510360）

摘要：目的 建立HPLC-ELSD法测定胆南星中4种胆酸类成分质量分数的方法。方法 色谱柱为WELCH AQ-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.2%（体积分数）冰醋酸（体积比60∶40），柱温为30℃，流速为1.0 mL/min，检测器为ELSD，载气流速为2.2 mL/min，漂移管温度为90℃。结果胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸均在定量范围内呈良好的线性关系，平均回收率分别为97.62%、98.38%、97.32%、97.86%。结论本方法操作简单，测定结果准确，可用于胆南星中胆酸类成分的质量分数测定及质量控制。

关键词：胆南星；HPLC-ELSD法；胆酸；猪去氧胆酸；鹅去氧胆酸；去氧胆酸

2015年版《中国药典》所记载的“胆南星”为制天南星的细粉与牛、羊或猪胆汁经加工而成，或为生天南星细粉与牛、羊或猪胆汁经发酵加工而成［1］。目前，胆南星疗效成分不完全清楚，胆汁为胆南星主要加工辅料，据现代实验药理学研究报道胆汁具有一定镇静、安神、调节心血管系统作用［2-3］，因此测定胆汁酸质量分数可以部分反映胆南星药用质量。古代胆南星炮制一般用牛胆汁，现在逐步发展成用牛胆汁、猪胆汁、羊胆汁，甚至可以采用混合胆汁。2015年版《中国药典》“胆南星”项下尚无检查项和含量测定项，其质量评价标准还未完善。由于有关原药材天南星的毒性物质基础研究比较少，与传统

网络出版时间：2016-05-24 15：34 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160524.1534.003.html药效相对应的活性成分还不清楚，不容易从中选择质量控制的指标成分，所以本研究参照文献［4-5］，选用胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸作为对照品，首次建立HPLC-ELSD法同时测定胆南星中4种胆酸类成分的质量分数测定方法。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（日本岛津公司），WELCH AQC18色谱柱，Dikma EasyGuard保护柱；3300 ELSD蒸发光散射检测器（美国奥泰公司）；XWK-Ⅲ无油空气泵（天津市津分分析仪器制造有限公司）；BP211D十万分之一电子天平（德国赛多利斯集团）；AY120万分之一电子天平（日本岛津公司）；SK250HP科导超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；ANKE TGL-16G-A恒温高速离心机（上海安亭科学仪器厂）。

胆酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：10078-0013），猪去氧胆酸对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号：MUST-14060906），鹅去氧胆酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110806-200303），去氧胆酸对照品（中国食品药品检定研究院，批号：724-8601）；甲醇（分析纯）；乙腈（色谱纯）；蒸馏水。

10批胆南星样品均产自四川，经广东药科大学中药学院李书渊教授鉴定符合《中国药典》标准，其来源详见表1。

表1 10批胆南星样品来源信息表Table 1 The information of 10 batches of Arisaema cum Bile

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液的制备

分别取胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸对照品适量，精密称定，置于50 mL容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸分别为0.205、1.024、0.952、0.398 mg的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

取胆南星（过4号筛）0.5 g，精密称定，置50 mL锥形瓶中，加甲醇10 mL，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，冷却，称定质量，加甲醇补足减失质量，置离心管中离心（12 000 r/min）10 min，取上清液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3 色谱条件及适应性试验

色谱柱：WELCH AQ-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），Dikma EasyGuard保护柱；流动相：乙腈-0.2%（体积分数，下同）冰醋酸（体积比60∶40），流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；蒸发光检测器载气流速：2.2 mL/min，漂移管温度：90℃。精密吸取混合对照品、供试品溶液各20 μL，按上述条件进行测定。色谱图见图1。

1.胆酸；2.猪去氧胆酸；3.鹅去氧胆酸；4.去氧胆酸。图1 混合对照品（A）、胆南星供试品（B）溶液的HPLCELSD色谱图Figure 1 The HPLC-ELSD chromatogram of mixed references （A）and Arisaema cum Bile（B）

2.4 线性关系的考察

分别取胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸混合对照品溶液0.1、1、2.5、5、10 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，得系列混合对照品溶液。分别精密吸取各混合对照品溶液20 μL，按照“2.3”项下条件进行测定。以对照品进样量对数为横坐标（X），峰面积的对数为纵坐标（Y）绘制标准曲线，结果见表2。由表2可知，4种胆酸成分均在测定范围内呈良好的线性关系。

表2 胆南星中4种胆酸类成分的线性范围、回归方程及r值Table 2 　The linear relationship，regression equations and rvalues of four cholic acids in Arisaema cum Bile

2.5 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液20 μL，按“2.3”项下条件进行测定，重复6次，记录胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸和去氧胆酸的峰面积，计算其RSD值分别为0.38%、0.86%、0.84%、1.33%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一批胆南星粉末（批号：20130901）约0.5 g，精密称定，按“2.2”项下制备供试品溶液，于室温下放置0、2、4、8、12、24 h后分别进样，按“2.3”项下色谱条件测定，记录胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸和去氧胆酸的峰面积，计算其RSD值分别为1.81%、1.48%、 1.72%、1.43%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验

取同一批胆南星粉末（批号：20130901）约0.5 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，重复操作6份。分别按“2.3”项下色谱条件测定并记录胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸和去氧胆酸的峰面积。计算得胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸和去氧胆酸质量分数的RSD值分别为2.86%、1.98%、2.21%、2.50%，表明方法重复性好。

2.8 加样回收率试验

取已知胆酸成分总质量分数的同一批胆南星粉末（批号：20130901）约0.25 g，共6份，精密称定，分别加入适量胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸和去氧胆酸对照品溶液，分别按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件测定，记录胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸和去氧胆酸的峰面积，计算其平均回收率分别为97.62%、98.38%、97.32%、97.86%，RSD值分别为2.11%、1.96%、1.86%、2.48%。结果见表3。

表3 胆南星中4种胆酸类成分的加样回收率试验结果Table 3 The recovery results of four cholic acids in Arisaema cum Bile（n=6）

2.9 样品测定

分别取10批胆南星样品粉末，各0.5 g，精密称定，每批重复操作2份，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下条件测定并记录胆酸、猪去氧胆酸、鹅去氧胆酸、去氧胆酸的峰面积，分别计算4种胆酸类成分的质量分数及其总质量分数。结果见表4。

表4 胆南星中4种胆酸成分及总质量分数的测定结果Table 4 The determination results of four cholic acids in Arisaema cum Bile（n=2）　w/%

3 讨论

本实验旨在研究建立同时测定胆南星中4种胆酸类成分的方法，从而为制定胆南星的质量标准提供依据。由张能荣［6］对牛、羊、猪胆汁中15种成分的研究结果可知：牛、羊胆汁中无猪去氧胆酸，猪胆汁中不含胆酸与去氧胆酸，而鹅去氧胆酸为3种胆汁共有的成分，据此可以判断市售的胆南星药材在炮制过程中加入了何种胆汁。从本试验结果可以看出，所检测10个批次的胆南星中采用的胆汁辅料大多是猪胆汁，部分批次采用的是混合胆汁；各样品胆酸类成分的质量分数差异较大，可能是由于加工过程中加入胆汁类型和加入胆汁量不同导致的——因此把胆酸类成分作为胆南星的质量控制指标是必不可少的。方法学考察结果表明，本法操作简单，测定结果准确、重复性好，可用于胆南星胆酸类成分的质量分数测定和质量控制。

参考文献：

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2015年版一部［M］.北京：中国医药科技出版社，2015：245.

［2］王凯平，石朝周.动物胆汁药用研究的概况与展望［J］.中国中医药科技，2000，7（5）：350-352.

［3］白万富，鞠爱华，杨乾.牛胆汁的化学成分及临床应用的研究进展［J］.中华中医药杂志，2008，23（2）：149-151.

［4］赫炎，张永欣，赵惠东，等.HPLC测定胆南星中猪去氧胆酸的含量［J］.中国中药杂志，2007，32（16）：1634-1636.

［5］王光函，姜鸿，邹桂欣，等.HPLC-ELSD法测定胆南星中胆酸含量［J］.亚太传统医药，2014，10（22）：8-9.

［6］张能荣.牛羊胆汁质量的研究［J］.中草药，1983，14（7）：15.

（责任编辑：刘晓涵）

中图分类号：R284.1

文献标志码：A

文章编号：1006-8783（2016）03-0311-04

DOI：10.16809/j.cnki.1006-8783.2016032301

收稿日期：2016-03-23

基金项目：广州市荔湾区科技计划（20133115008）

作者简介：蔡宇忆（1991—），女，2013级硕士研究生，Email：406371983@qq.com；通信作者：李书渊（1963—），女，教授，从事中药物质基础和质量标准研究，Email：1018720684@qq.com。

Determination of cholic acid constituents from Arisaema cum Bile by HPLC-ELSD

CAI Yuyi1，YE Yonghao1，YANG Liying1，HUANG Yumei2，WU Zhijian2，MA Yongde2，LI Shuyuan1
（1.School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China；2.Guangzhou Materia Company，Guangzhou 510360，China）

AbstractObjective To develop a HPLC-ELSD method for the determination of cholic acids from Arisaema cum Bile.Methods WELCH AQ-C18column 4.6 mm×250 mm 5 μm was employed and eluted at 30℃with a mobile phase consisting of acetonitrile-0.2%glacial acetic acid 60∶40 and the flow rate was 1.0 mL/min.The drift-tube temperature of ELSD was 90℃ and the flow rate of air was 2.2 mL/min. Results Cholic acid hyodeoxycholic acid chenodeoxycholic acid and deoxidation cholic acid had good linearity within the quantitative range and their mean recovery ratios were 97.62% 98.38% 97.32%and 97.86% respectively.Conclusion The method was simple and accurate which could be used for the determination and quality control of cholic acid constituents from Arisaema cum Bile.

Key wordsArisaema cum Bile HPLC-ELSD cholic acid hyodeoxycholic acid chenodeoxycholic acid deoxidation cholic acid