响应面法优化中空介孔二氧化硅球包载吲哚美辛的工艺研究

王海媛，孙明辉，任智慧，周芳，晋兴华（天津大学药物科学与技术学院，天津 300072）



研究开发

响应面法优化中空介孔二氧化硅球包载吲哚美辛的工艺研究

王海媛，孙明辉，任智慧，周芳，晋兴华
（天津大学药物科学与技术学院，天津 300072）

摘要：采用硬模板法在室温下、中性水溶液中合成了中空介孔二氧化硅球，中空部分直径为 250nm，外壳厚度25nm。利用氮气吸附-解吸附、透射电子显微镜、傅里叶变换红外光谱表征了微球的物理化学性质。该微球球形度良好，BET结果显示其比表面积为730.0m2/g，平均孔容1.084cm3/g，平均孔道直径6.58nm。利用中空介孔二氧化硅球较好的载药性能负载吲哚美辛，并采用三因素的Box-Behnke实验设计对药物负载处方工艺进行优化研究。当IMC/HMSNs质量比为22:1，超声1.4h，震荡吸附23h时实验条件达到最佳，包封率理论值为85.2%。在此条件进行验证实验，吲哚美辛的包封率可达理论预测值的98.7%，说明将 Box-Behnken 实验设计法用于中空介孔二氧化硅球包载吲哚美辛的优化筛选是可行的，且得到的实验观察值与数学模型的预测值相符合。

关键词：中空介孔二氧化硅球；吲哚美辛；Box-Behnken实验；包封率

吲哚美辛（Indomethacin，IMC），又名消炎痛，是一种非甾体消炎药，是最强的环氧酶抑制剂之一，具有解热、抗炎、抗风湿的作用，临床上主要用于急性风湿性及类风湿性关节炎的治疗。此外，有研究表明吲哚美辛具有良好的抗肿瘤作用[1-3]，该药被认为是比扑热息痛和阿司匹林更具有发展前景的药物。吲哚美辛为BCSⅡ类药物（生物药分类系统，biophamacecitieal classification system），其脂溶性好，但水溶性极差（5μg/mL，25℃），普通制剂如片剂、胶囊剂、软膏、栓剂等生物利用度低，且易引发胃肠道损害、肝损害、肾损害及中枢神经疾病，因此研发吲哚美辛新剂型，寻找增加其溶解性和生物利用度的包载材料，提高生物利用度，减少不良反应成为人们关注的主要问题[4]。

中空介孔二氧化硅球（hollow mesoporous silica nanoparticles，HMSNs）作为一种新型载体，兼具空心和多孔微球的双重优点，其水热稳定性好、纳米级孔道结构完整、孔径范围可调、生物相容性好、比表面积大、负载量高[5-6]，特别是在催化[7-8]、药物装载和控制释放[9-13]等方面具有良好的应用前景。实验采用中空介孔二氧化硅球来包载吲哚美辛以提高药物溶解性，增加其生物利用度，并利用响应曲面法（response surface methodology，RSM）中的Box-Behnken实验设计（Box-Behnken design，BBD）对吲哚美辛负载的处方工艺进行优化研究[14-16]。

1 实验材料与仪器

1.1 实验材料与仪器

材料：吲哚美辛、过硫酸钾，上海晶纯实业有限公司；正硅酸乙酯，天津市博迪化工有限公司；十六烷基三甲基溴化铵、无水乙醇，天津光复精细化工研究所；苯乙烯、4-乙烯基吡啶，北京百灵威科技有限公司，各试剂均为分析纯，水为超纯水，Milli-Q Academic。

仪器：Agilent Cary 60紫外分光光度计；Anke TGL-16G高速台式离心机；KE-BEI型电热恒温水浴锅；Mettler toledo XS105型电子天平；SX2-4-10马弗炉；QT2060超声清洗机；WH-7401-50B电动搅拌器；Tensor 27傅里叶变换红外光谱仪；JEOL-100CX-II透射电子显微镜；Tecnai G2 F20场发射透射电子显微镜；V-Sorb4800比表面检测仪。

1.2 实验方法

1.2.1 中空介孔二氧化硅球的合成

在三口烧瓶中，加入去离子水170mL、一定量的4-乙烯基吡啶与苯乙烯（体积比 1∶2），氮气保护下磁力搅拌30min后加入0.36g过硫酸钾粉末（K2S2O8），80℃反应24h，得到模板微球（PS-co-P4VP），离心水洗3次，存放于去离子水中。称取一定量十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）于250mL烧瓶中，加入180mL去离子水、6.8mL正硅酸乙酯，超声混合后加入10mL模板微球乳液，室温下搅拌48h，80℃沉积2h，离心乙醇洗涤 3次，自然晾干，得到复合微球PS-co-P4VP@SiO2，马弗炉中550℃煅烧6h，冷却至室温，得到中空介孔二氧化硅球HMSNs。

1.2.2 药物负载实验

利用溶剂浸渍法进行中空介孔二氧化硅球的载药实验。称取2.5mg HMSNs加入到5mL、12mg/mL的吲哚美辛乙醇溶液中（IMC/HMSNs质量比为24∶1），超声1.0h，密封、避光，放入37℃恒温震荡器中震荡18h后，10000r/min离心5min，取上清，用紫外分光光度法 320nm处测定吲哚美辛的吸光度，从而计算HMSNs的包封率。根据式（1）测定吲哚美辛的包封率EE。

式中，EE为吲哚美辛的包封率；M总为加入的吲哚美辛的总质量；M游离为离心后上清液中剩余的吲哚美辛的质量。

1.2.3 实验设计与数据处理方法

采用Design-Experts 8.0.6软件中的BBD实验进行试验设计与数据分析。以IMC/HMSNs质量比、载药时间、超声时间3个因子为自变量，分别以A、B、C表示，以吲哚美辛包封率为响应值（Y），并根据现有实验条件，在单因素考察的基础上，确定了各影响因素合适的条件范围，依次为16∶1～32∶1、12～24h、0.5～1.5h，按照方程x=(X–X0)/∆X对自变量进行编码（x为自变量的编码值，X为自变量的真实值，X0为实验中心点处自变量的真实值，∆X为自变量的变化步长），并以自变量的编码值+1、0、–1分别代表自变量的高、中、低水平的编码值，实验自变量因素编码及水平见表1。

2 结果与讨论

2.1 中空介孔二氧化硅球的合成与表征

表1 Box-Behnken 实验自变量因素编码及水平

虽然许多研究者通过模板辅助的溶胶-凝胶过程成功合成了 HMSNs，但仍无法有效的避免不必要和不规则的聚集体形成。采用直接包覆法制备核壳结构微球过程中会有大量前体或水解产物不能全部包覆在硬模板外面，而以沉淀的形式直接析出。

在本研究中，CTAB表面活性剂和PS-co-P4VP核壳微球作为双重模板用来形成HMSNs的介孔和空心。选择 PS-co-P4VP核壳微球作为模板剂，首先是因为包含PS核心和P4VP外壳的模板微球，外层为未成键的路易斯碱性P4VP链，可以作为催化剂启动在模板上的 TEOS溶胶-凝胶过程。另一方面，PS-co-P4VP模板微球通过一级无皂乳液聚合可以很容易的合成，这为后续实验的进行提供了很大的便利和经济效益。

2.1.1 透射电镜分析

从PS-co-P4VP、PS-co-P4VP@SiO2和SiO2透射电镜图可以看出，中空微球形态完整，壳层均匀，球形度良好，尺寸约为300nm，SiO2外壳为25nm。图1中(d)为高倍透射电镜下的微球，从中可以看见明暗相间的孔道。

图1 不同样品的透射电镜图

2.1.2 氮气吸附-解吸附

利用氮气吸附-解吸附方法测定微球的表面积，孔径分布和孔容量等。HMSNs的吸附-脱附等温曲线（图2）属于IV型等温线，是介孔材料典型的吸附等温线。同时，在0.6～1.0的相对氮气压范围内，脱附等温线和吸附等温线之间存在一个明显的滞后环，这表明制备的HMSNs具有介孔结构、相对较窄的孔径分布。

图2 氮气吸附-脱附等温曲线和孔径分布曲线

根据HMSNs的吸附-脱附等温线计算相应的孔径分布，利用脱附支数据作图得到介孔材料的孔径分布图。1.1nm处的小窄峰，结合吸附支数据考虑是由脱附支的TSE现象引起的假峰，而在2.0～5.0nm处显示一个狭窄的孔隙大小分布，在 3.29nm处达到峰值，即孔道半径为3.29nm，直径6.58nm。BET结果显示HMSNs比表面积为729.963m2/g，BJH计算得到孔体积为 1.084 cm3/g、平均孔径为6.58nm。

2.1.3 傅里叶变换红外光谱

观察复合微球的红外光谱图（图3中c线）发现，1475cm–1、1397cm–1处存在CTAB中—CH3反对称变形振动和对称变形振动；1600～1400cm–1范围内多处吸收峰为苯环的特征吸收峰，3026cm–1为吡啶环上C—H的伸缩振动，3064cm–1为苯环上环氢的伸缩振动，均为模板微球 PS-co-P4VP的特征吸收峰，红外特征吸收峰的存在证明了 CTAB和PS-co-P4VP双重模板功能。

经 550℃煅烧，模板剂的特征吸收峰均消失，仅存SiO2的6个特征峰（图3中d线）。1087cm–1处的Si—O—Si反对称伸缩振动，805cm–1、464cm–1处的Si—O键对称伸缩振动和弯曲振动，3447cm–1处的Si—OH反对称伸缩振动，1632cm–1附近水的H—O—H弯曲振动，967cm–1处的Si—OH的弯曲振动吸收。

对比SiO2（图3中d线）和PS-co-P4VP@SiO2（图3中c线）在1087cm–1和967cm–1处的特征吸收峰发现，967cm–1处Si—OH中等强度吸收峰，说明仍有大量Si—OH未缩合成Si—O—Si键，硅骨架不牢固；煅烧后的 SiO2微球1087cm–1处吸收峰强度明显加大，同时 967cm–1处吸收峰强度不断减小，说明煅烧过程使部分Si—OH缩合成Si—O—Si键，增大了硅骨架强度。

图3 傅里叶变换红外光谱图

2.2 HMSNs载药实验及BBD设计

综合考虑，选择IMC/HMSNs质量比、载药时间、超声时间进行单因素实验，实验得到的最优条件为IMC/HMSNs质量比24∶1，载药时间18h，超声时间1.0h，

2.2.1 实验设计

该优化实验采用Design-Experts 8.0.6软件中的中心组合实验设计 BBD原理，确定响应面的实验方案。选取IMC/HMSNs质量比A、载药时间B、超声时间C为自变量，以吲哚美辛的包封率为响应值，进行3因素3水平的响应曲面分析实验。根据单因素实验结果，以实验最优值为中心值，设计了17个试验，其中分析因子试验12个，零点试验5个，试验方案及结果见表2。

采用Design-Experts 8.0.6软件对实验结果进行响应曲面分析，利用向后剔除法除去不显著项。回归方程为Y=53.05+1.63A+0.09B+7.21C+0.13AC+ 0.13BC–0.04A2–2.73C2，相关系数R2=0.9993，说明二次回归方程线性相关性良好，方程与实验结果匹配度高。调整相关系数则用来解释回归模型的充分性和适用性，根据自变量个数和样本量的大小对相关系数进行调整，Adj-R2=0.9993，说明模型预测值与实验真实值之间具有很高的相关性。

回归方程各项的方差分析结果见表 3。二次回归模型的F值为1883.07，P<0.0001，远小于一般显著性检验规定的α（0.05或0.01），说明该方程显著性良好。而失拟项F=0.68，明显小于F0.05[F0.05(3,2)=19.2]，模型拟合度良好；失拟项P=0.6637（>0.01），二次回归模型失拟度不显著，说明模型拟合效果好，试验误差小，不存在失拟因素，可用于HMSNs负载吲哚美辛的实验条件优化。通过P值分析，A、B、C、AC、BC、A2、C2项均达到了极显著水平（P<0.01），表明IMC/HMSNs质量比、载药时间、超声时间以及IMC/HMSNs质量比与超声时间、载药时间与超声时间的交互作用对吲哚美辛包封率均有显著影响。

表2 Box-Behnken 实验设计结果

表3 回归方程各项的方差分析

2.2.2 响应面交互作用与优化

IMC/HMSNs质量比与载药时间相互作用显著，但对包封率变化影响不大[图4(a)]。IMC/HMSNs质量比与超声时间交互作用明显，且坡度变化大，对包封率影响显著[图 4(b)]。载药时间与超声时间作用不显著但对响应值作用明显[图 4(c)]。综合考虑各因子的线性、二次及交互作用3方面的影响，在试验考察范围内，3个因素对包封率的影响依次为：IMC/HMSNs质量比、载药时间、超声时间。由3D图可以发现，响应值存在最大值，进一步通过软件分析计算，得到中空介孔二氧化硅球负载吲哚美辛的最佳实验条件（表4）：IMC/HMSNs质量比为22∶1，载药时间23h，超声时间1.4h，包封率达85.2%。在得到的最佳负载条件下，进行3次验证试验（表5），包封率为84.1%，与理论预测值基本吻合，吻合度可达98.7%，证明了回归模型的可行性。因此采用响应曲面法优化得到的HMSNs负载吲哚美辛的实验参数准确可靠，具有一定的实用价值。

图4 IMC/HMSNs质量比、载药时间与超声时间对包封率影响的响应曲面和等高线图

表4 BBD优化结果

表5 验证实验结果

3 结 论

利用响应曲面法对HMSNs负载吲哚美辛的处方工艺进行优化，通过实验和计算分析，以 22∶1的质量比，超声1.4h，震荡吸附23h时实验条件达到最优，预测包封率可达85.2%，明显优于现有的载体材料。在修正条件下对实验结果进行验证实验，得到中空介孔二氧化硅球包封率为84.1%。与理论预测值基本吻台，说明该回归模型是合理有效的，为纳米材料负载药物的研究提供了新的实验依据。

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第一作者：王海媛（1991—），女，硕士研究生。联系人：晋兴华，博士，讲师。E-mail 15822534131@163.com。

中图分类号：R 944.9

文献标志码：A

文章编号：1000-6613（2016）07-2145-06

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.07.030

收稿日期：2015-11-23；修改稿日期：2015-12-09。

Optimization of indomethacin loaded hollow mesoporous silica nanoparticles by response surface method

WANG Haiyuan，SUN Minghui，REN Zhihui，ZHOU Fang，JIN Xinghua
（School of Pharmaceutical Science and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China）

Abstract：The hollow mesoporous silica nanoparticles(HMSN) were synthesized in neutral aqueous solution at room temperature.Following this method，well-defined HMSN was prepared with a 25nm shell and a 250nm hollow diameter.Nitrogen adsorption-desorption analysis，Trans-mission electron microscopy，Fourier Transform Infrared Spectrometer were applied to characterize the synthesized HMSNs.The morphology of the HMSN was spherical.The BET result shows that the specific surface area of HMSN was 730.0m2/g，the average pore size was 1.084cm3/g，and the pore diameter was 6.58 nm.Experiments were designed according to a three-level Box-Behnken design to optimize the Indomethacin loaded HMSNs.The result indicated that HMSNs exhibited an excellent drug loading capacity.The optimal formulation parameters were as follows：IMC/HMSNs mass ratios(A)，loading time(B) and ultrasonic time(C) levels were 22∶1，1.4h and 23h，respectively and the best encapsulation efficiency could be 85.2%.The observed responses were in good agreement with the predicted values of the mathematic models，so the Box-Behnken design is suitable for optimizing the formulation of indomethacin loaded hollow mesoporous silica nanoparticles.

Key words：HMSNs；indomethacin；Box-Behnken design；encapsulation efficiency