HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶联物联合苦杏仁苷体外对膀胱癌EJ细胞杀伤作用的研究

张　冲，刘丽春，郭利君，王　磊

（甘肃省人民医院，甘肃 兰州 730000）



HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶联物联合苦杏仁苷体外对膀胱癌EJ细胞杀伤作用的研究

张冲，刘丽春，郭利君*，王磊

（甘肃省人民医院，甘肃 兰州 730000）

摘要：目的 本实验将鼠源性免疫球蛋白G1（以下简称HMFG1）与β-葡萄糖苷酶连接，研究HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶联物联合苦杏仁苷在体外特异性杀伤人膀胱癌细胞（以下简称EJ细胞）的作用，探讨HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶联物联合苦杏仁苷用于膀胱癌治疗的前景。方法 将不同浓度的苦杏仁苷加入HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶联物、HMFG1单抗、HMFG1单抗加β-葡萄糖苷酶中，作用于EJ细胞，采用四氮噻唑蓝比色法（以下简称MTT法）与水溶性四唑盐比色法（以下简称WST-8法）进行实验。结果 在不同方法下，不同苦杏仁苷浓度的HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶联物对EJ细胞的杀伤活性吸光度值与其他组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；在不同方法下，各组对EJ细胞的抑制率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。偶联物在250 mmol·l-1浓度下，MTT法IC50为2.12 mmol·l-1、WST-8法IC50为1.17 mmol·l-1。结论 本实验证明HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶联物联合苦杏仁苷具有明显特异性杀伤EJ细胞的作用，HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶联物联合苦杏仁苷可能成为治疗膀胱癌的有效策略，可以进入动物实验进行进一步验证。

关键词：HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶联物；苦杏仁苷；EJ细胞

苦杏仁苷（amygdalin）在自然界中主要存在于苦杏、苦扁桃、油桃、枇杷、苹果、黑樱桃等果仁和叶子当中，1920年美国首次将苦杏仁苷用于治疗肿瘤。苦杏仁苷产生的氰化物虽然能杀伤肿瘤细胞，但缺乏特异性，对机体可造成严重的系统毒性［1］。为了发挥苦杏仁苷的抗肿瘤作用，本实验将HMFG1（鼠源性免疫球蛋白G1）与β-葡萄糖苷酶连接，使酶与抗体偶联为一体。采用MTT（四氮噻唑蓝比色法）［2］与WST-8法（水溶性四唑盐比色法）研究HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶联物兼有抗原MUC1结合活性及水解苦杏仁苷的β-葡萄糖苷酶活性，对EJ细胞（人膀胱癌细胞）有特异性杀伤作用，为治疗膀胱癌、降低复发率、控制术后转移提供进一步的实验基础，现介绍如下。

1　材料与方法

1.1试剂与仪器

EJ细胞购于中科院上海细胞库；RPMI-1640（Roswell Park Memorial Institute）培养基（美国Gibco公司）；新生小牛血清（兰州荣晔生物科技有限责任公司）；胰蛋白酶粉末（美国Gibco BRL公司）；MTT（美国Fluka公司）；HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶联物、CCK-8试剂盒（同仁化学研究所）；苦杏仁苷（美国波士顿生物技术公司）。仪器：CO2细胞培养箱（型号：shellab 2306）；酶标仪（ELX800型）；细胞培养瓶、96孔培养板（丹麦NuNc公司）；倒置显微镜（日本Olympus产品）。

HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶联物的制备：本实验选用异型双功能交联剂间-马来酰亚胺基苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯（MBS）。MBS具有两个不同的选择性反应基团，N-羟基琥珀酰亚胺酯可专一地与蛋白质分子中的氨基结合，马来酰亚胺可与蛋白质中的巯基反应，再通过还原剂2-亚胺基四氢噻吩（2-IT）与单抗反应，在抗体中引入了巯基，使先与β-葡萄糖苷酶的氨基结合了的MBS只能同巯基化的抗体结合，避免了连接反应中抗体与抗体、酶与酶之间的自身聚合，提高了交联反应的效率。

1.2方法

1.2.1MTT法 分为：（1）HMFG1单抗-β-葡萄糖苷酶偶联物组；（2）HMFG1单抗加β-葡萄糖苷酶组；（3）HMFG1单抗组。准备苦杏仁苷溶液，浓度分别为1 mmol·l-1，5 mmol·l-1，10 mmol·l-1，15 mmol·l-1。将对数生长的EJ细胞接种于96孔板（1×105/孔），待细胞贴壁后［3-4］去除培养基，分别加入以上3组药物，终浓度为250 mmol·l-1，不加药组为阴性对照组，并以不加细胞只加培养基作为空白进行调零。继续培养2小时，然后用无血清RPM-1640培养基洗3次，再在3组中加入4个浓度的苦杏仁苷，每个浓度设3个复孔，继续培养24小时。然后加入MTT 20 μl/孔（浓度5 mg/ml），培养4小时，吸去上清液，加入DMSO 150 μl/孔，充分震荡10分钟，放入酶标仪，在490 nm下测定各孔吸光度值（A），取平均值，按公式计算细胞抑制率：细胞抑制率=（1-A实验组/A对照组）×100%，求出细胞生长抑制50%时的苦杏仁苷浓度，即IC50值，并进行比较。

1.2.2WST-8法 分为：（1）HMFG1单抗-β-葡萄糖苷酶偶联物组；（2）HMFG1单抗加β-葡萄糖苷酶组；（3）HMFG1单抗组。准备苦杏仁苷溶液，浓度分别为 1 mmol·l-1，5 mmol·l-1，10 mmol·l-1，15 mmol·l-1。将对数生长的EJ细胞接种于96孔板（1×105/孔），37℃，5%CO2培养箱培养12小时，待细胞贴壁后，分别加入以上3组药物，终浓度为250 mmol·l-1，不加药组作为阴性对照组，并以不加细胞只加培养基作为空白进行调零。继续培养2小时，然后用无血清RPM-1640培养基洗3次，再在3组中加入4个浓度的苦杏仁苷溶液，每个浓度设3个复孔，继续培养24小时。然后加入CCK-8 10 μl/孔，培养4小时，充分震荡10分钟，放入酶标仪，在450 nm波长下测定各孔吸光度值（A）。计算IC50值同上，之后进行比较。

1.3数据统计

数据采用SPSS15.0软件统计［5］，组间比较采用方差分析，IC50的计算用Probit分析，两方法比较采用非参数两相关样本Wlicoxon统计分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

由结果可以看出，采用不同方法，结果均显示HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶联物组有较强的细胞抑制作用，对苦杏仁苷呈剂量依赖性。偶联物组与其他各组间的吸光度值比较，有显著性差异（P＜0.01）。在不同方法下，各组对EJ细胞的抑制率比较，无显著性差异（P＞0.05）。经计算，药物剂量曲线［6］显示，MTT法IC50为2.12 mmol·l-1，WST-8法IC50为1.17 mmol·l-1，见表1～3。

3　讨论

膀胱癌是国内男性泌尿生殖系统肿瘤中最常见的恶性肿瘤，据中国癌症基金会肿瘤数据库统计显示，膀胱癌的发生约占所有恶性肿瘤的5%，并呈逐年上升趋势。在膀胱癌中，90%以上为移行细胞癌，膀胱癌术后极易复发，复发率为80%，其中10%进展为较高分级。为治疗以及降低术后复发率，通常采用膀胱灌注药物局部化疗，但用化疗药物进行膀胱灌注时也能被机体吸收，造成全身毒性反应，且治疗效果并不理想。这就需要研制出一种新的、特异性高的药物，能够在早期识别并靶向杀伤膀胱肿瘤细胞，降低术后复发率，且对正常组织细胞无毒性作用或毒性作用很小，减轻患者痛苦，提高其生存质量［7］。

从天然产物中提取的苦杏仁苷本身毒性很低，但经β-葡萄糖苷酶水解后能产生氰化物，且有极强的细胞毒性。正常细胞中存在硫氰酸酶，可将一部分氰化物转化为无毒的硫氰酸盐，而肿瘤细胞无硫氰酸酶，所以对肿瘤细胞的作用更明显［8］。HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶联物就是一种针对肿瘤细胞特异性高表达的MUC1黏蛋白，且符合（Antibody Directed Enzyme Prodrug Therapy，ADEPT）理念［9］的前体药物。本实验采用MTT法与WST-8法测定不同浓度的苦杏仁苷与偶联物联合共同作用于膀胱癌EJ细胞24小时后的抑制率，结果显示，1 mmol·l-1、5 mmol·l-1、10 mmol·l-1、15 mmol·l-1的苦杏仁苷溶液与HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶联物联合共同作用后，表现出明显的抑制效应，与其他各组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），并且随着苦杏仁苷浓度的加大而增加，呈现剂量依赖性。MTT法IC50为2.12 mmol·l-1、WST-8法IC50为1.17 mmol·l-1，从而证明HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶联物联合苦杏仁苷具有特异性杀伤EJ细胞活性的作用，提示HMFG1-β-葡萄糖苷酶偶联物联合苦杏仁苷可能是治疗膀胱癌、进行早期干预、降低复发率、进行个体化治疗、改善预后、控制术后转移的有效策略，值得进一步研究。

表1　MTT法不同组EJ细胞特异性杀灭活性吸光度值（±s）

表1　MTT法不同组EJ细胞特异性杀灭活性吸光度值（±s）

注：*与其他组比较，P＜0.01

苦杏仁苷浓度1 mmol·l-15 mmol·l-110 mmol·l-115 mmol·l-1单抗加酶组0.639±0.006 0.618±0.005 0.420±0.008 0.340±0.009阴性对照组0.678±0.008 0.678±0.008 0.678±0.008 0.678±0.008偶联物组0.620±0.007*0.604±0.006*0.429±0.009*0.268±0.008*单抗组0.658±0.007 0.621±0.008 0.601±0.009 0.467±0.006

表2　WST-8法不同组EJ细胞特异性杀灭活性吸光度值（±s）

表2　WST-8法不同组EJ细胞特异性杀灭活性吸光度值（±s）

注：*与其他组比较，P＜0.01

单抗加酶组0.629±0.008 0.607±0.005 0.413±0.010 0.328±0.009苦杏仁苷浓度1 mmol·l-15 mmol·l-110 mmol·l-115 mmol·l-1阴性对照组0.667±0.008 0.667±0.008 0.667±0.008 0.667±0.008偶联物组0.610±0.009*0.594±0.007*0.418±0.006*0.264±0.005*单抗组0.647±0.008 0.611±0.007 0.591±0.006 0.466±0.006

表3　MTT法与WST-8法不同组对EJ细胞的抑制率比较（%）

参考文献：

［1］沈映君.中药药理学［M］.2版.北京：人民卫生出版社，2011.

［2］方蓉，李芳秋，武建国，等.MTT比色法的条件探讨［J］.临床检验杂志，2003，21（1）：34-35.

［3］张卓然.实用细胞培养技术［M］.北京：人民卫生出版社，2001.

［4］叶兰萍，徐华，苟海涛，等.重离子对人肝癌细胞凋亡及bcl-2/bax基因表达的研究［J］.兰州大学学报：医学版，2006，32（2）：1-3.

［5］胡志洁.SPSS 11.5软件在正交试验设计中的应用［J］.医学信息，2007， 20（5）：737-740.

［6］刘桂芬.医学统计学［M］.2版.北京：中国协和医科大学出版社，2007.

［7］Kaufman D S，Shiply W U，Feldman A S.Bladder cancer［J］.Lancet，2009，373（9686）：239-249.

［8］许宁侠.苦杏仁苷的研究进展［J］.内蒙古中医药，2012（9）：66-67.

［9］Schellmann N，Deckert P M，Bachran D，et al.Targeted enzyme prodrug therapies［J］.Mini-Rev in Medic Chem，2010，10（10）：887-904.

（*通讯作者：郭利君）■

中图分类号：G642.423

文献标识码：B

文章编号：1671-1246（2016）12-0146-02

基金项目：甘肃省科技厅自然基金项目（0710RJZA008）