糖尿病对直结肠癌小鼠生存的影响

刘虹，龚志军，卿笃桔，李恩就，黎飞江门市中心医院胃肠外科，广东江门　529000



糖尿病对直结肠癌小鼠生存的影响

刘虹，龚志军，卿笃桔，李恩就，黎飞
江门市中心医院胃肠外科，广东江门529000

［摘要］目的探讨糖尿病对直结肠癌小鼠生存及预后的影响。 方法BALB/c小鼠60只，观察时间2013年3月—2013 年4月，共4周，小鼠饲养于中山大学北校区实验动物中心，随机分为3组，每组20只，分别为A组：结直肠癌组，B组：糖尿病结直肠癌组，C组：对照组。B组小鼠腹腔注射四氧嘧啶建立高血糖模型。体外培养小鼠结肠癌细胞株CT26至对数生长期，制成单细胞悬液。并将此细胞悬液注入A、B组小鼠皮下，C组小鼠在皮下注入生理盐水。观察各组小鼠的生存时间、体重差、并发症（肠梗阻、肠粘连、血性腹水等）的发生率及时间。建模成功4周后处死存活的小鼠，取静脉血测定肌酐、尿素氮、谷丙转氨酶和谷草转氨酶以明确肝肾功能，解剖、大体观察皮下肿瘤的生长和浸润，病理学检查是否有肝脏转移及转移瘤数量。结果处死前称重，A、B组小鼠体质量分别为 （15.38±3.39）g和 （14.65± 2.59）g，与造模前相比明显减轻（A：19.23±0.25 g，B：21.15±0.33 g），差异有统计学意义（P＜0.05），但A、B组之间的差异无统计学意义（P＞0.05）。3组小鼠的肝肾功能与造模前相比无明显变化。A、B组注射部位皮下肿瘤体积比造模前明显增大，差异有统计学意义（P＜0.05），且B组体积大于A组。结论糖尿病能促进结直肠癌肿瘤的生长和转移，增加并发症的发生率和严重程度，并可能提高死亡率。

［关键词］糖尿病；结直肠癌；小鼠；并发症；预后

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是结肠癌（colon cancer）和直肠癌（rectal cancer）的统称，在我国的发病率逐年增加［1-2］。结直肠癌是发病率仅次于胃癌和食管癌的消化道肿瘤［3］，但到目前为止，对其病因和发病机制尚不明了。近年来的研究发现CRC的发病与糖尿病（diabetes mellitus，DM）关系密切［4］。DM患者中恶性肿瘤的发病率远远高于普通人群各年龄段的最高发病率，其中又以消化道肿瘤为多见，结直肠癌患者的5年生存率在50%～60%［5］。如何延长患者的生存时间、提高生存质量并改善预后是临床面临的主要问题。本实验中我们建立DM及CRC小鼠，以了解DM对CRC患者生存和预后的影响。

1资料与方法

1.1材料与试剂

细胞与主要试剂：小鼠结肠癌细胞系CT26，DMEM培养液，吡格列酮（pioglitazone），二甲基亚砜（DMSO），四氧嘧啶，实验动物与分组：6～8周龄的雌性BALB/c小鼠60只，体质量 16～20 g，随机分为3组，每组20只，分别为A组：CRC组，B组：DM CRC组，C组：对照组。观察时间2013年3月-2013年4月，共4周，小鼠饲养于中山大学北校区实验动物中心。

1.2方法

1.2.1 DM造模 B组小鼠采用腹腔注射四氧嘧啶建立高血糖模型。小鼠禁食12 h后，生理盐水配置提及分数为10%的四氧嘧啶注射液，以250 mg/kg腹腔内注射。72 h后取尾静脉血，2000 r/min离心5min，上层血清用葡萄糖氧化酶法测定小鼠血糖，若血糖值在11.1 mmol/L ～30.0 mmol/L之间为造模成功。

1.2.2 CRC造模 用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养小鼠结肠癌CT26细胞，置于37℃、5%CO2培养箱中，0.25%的胰酶消化传代，培养至对数生长期，制成浓度为1×106个/ml的单细胞悬液。将此细胞悬液直接注射入A、B组小鼠左侧颈背部皮下，建立小鼠结肠癌CT26模型。8d后注射部位皮下出现小包块，直径2～3 mm，视为造模成功。C组小鼠采用相同的方法在左颈部皮下注入生理盐水。

1.3观察指标

1.3.1大体观察 接种后观察各组小鼠有无死亡、并发症（肠梗阻、腹泄等）出现的例数和时间，并每周测量体质量。

1.3.2血清学监测 处死前取尾静脉血，酶联免疫分析法测量尿素氮、肌酐、谷丙转氨酶、谷草转氨酶以监测小鼠肝肾功能。

1.3.3病理学观察造模成功4周后处死存活小鼠，剖腹观察肿瘤的生长和浸润情况，完整取出肿瘤后，用游标卡尺测量肿瘤的最长直径 （a，cm）及其垂直径（b，cm），计算肿瘤体积（V，cm3），V=1/2×ab2。再与肝脏组织一起，经4%多聚甲醛溶液固定24 h后，乙醇梯度脱水、二甲苯透明，常规石蜡包埋，5 um厚连续切片。60℃烤箱中放置4 h后于37℃过夜。脱蜡后蒸馏水冲洗3遍，苏木精-伊红染色，观察局部肿瘤的生长和浸润以及有无肝转移。

1.4统计学分析

采用SPSS 11.0统计软件对数据进行处理，计数资料用（±s）表示，组间比较采用方差分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2结果

2.1一般情况

观察期内3组小鼠均无死亡，但A、B组小鼠的活动明显减少和迟缓，进食和精神状态差，C组小鼠活动正常。A、B组小鼠皮下包块逐渐增大，于第三周时出现排便减少，有时有稀便。处死后称重，A、B组小鼠体质量分别为（15.38±3.39）g和（14.65±2.59）g，与造模前相比明显减轻A：（19.23±0.25）g、B：（21.15±0.33）g，差异有统计学意义（P＜0.05），但A、B组之间的差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1　造模前后3组小鼠的体质量变化表（±s）

表1　造模前后3组小鼠的体质量变化表（±s）

注：与造模前相比*P＜0.05。

组别（n=20）　造模前　　造模后A B C 19.23±0.25 21.15±0.33 20.77±0.31 15.38±3.39* 14.65±2.59* 21.24±0.46

2.2血清学监测

3组小鼠的肌酐、尿素氮、谷丙转氨酶和谷草转氨酶与造模前接近，差异无统计学意义（P＞0.05），组间差异亦无统计学意义（P＞0.05）。

2.3病理学观察

C组小鼠注射局部和肝脏均未发现有肿瘤生长和浸润。A、B组小鼠皮下注射部位均可见明显的肿块，边缘不清楚，与周围组织连结紧密，呈浸润性生长，其中A组肿瘤体积为 （2.518±0.102）cm3，B组肿瘤体积为 （3.478± 0.159）cm3，均与造模成功时V=（0.013±0.026）cm3有明显增大（P＜0.05），且两组差异有统计学意义（P＜0.05）。同时，A组小鼠有14只在肝脏发现占位病变，B组18只小鼠发现肝脏占位，均为多发，病理检查均证实为小鼠结肠腺癌，两组例数差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2　造模前后3组小鼠的肿瘤体积变化表（cm3，n=60）

3讨论

近年来CRC的发病率逐渐增高，常规治疗效果并不理想，05年其全球死亡人数位于第四位，仅次于肺癌、胃癌和肝癌［6-7］。最近的研究表明，DM患者发生CRC的风险比非DM患者增加了30%，另有研究认为与其他人相比，DM患者患CRC的风险高60%，且此患病率与DM病程的长短密切相关［8-9］。其原因有学者认为可能与两种疾病有相同的致病因素（如高蛋白、高脂肪、高热卡、低纤维素、少运动等）有关，也有人认为与DM患者体内存在胰岛素抵抗引起的内源性高胰岛素血症、高血糖、氧化应激与炎症以及性激素水平异常有关［10-11］。也有研究认为胰岛素及其结构类似物IGF-Ⅰ可能对CRC的发生起促进作用，并增加患肿瘤的老年男性的死亡风险［12-13］。长期的高血糖和高胰岛素状态均不同程度的促进肿瘤生长，且胰岛素直接进入肝脏，故DM患者也较容易发生肝癌和胰腺癌。本研究中动物的CRC采用人工方法造模而成，与DM的各种影响无关。DM人群患恶性肿瘤的风险较高，分期一般较晚，治疗效果差，预后多不良。有分析认为，合并DM的肿瘤患者与无DM肿瘤患者相比，全因死亡率增高，DM组患者的思维风险是非DM组的3.58倍［14-15］。临床研究发现，在未化疗的结肠癌患者中，DM与非DM患者的结肠癌相关的死亡风险相似［16］。我们的前期研究也认为，DM对结肠癌复发转移风险的影响仅限于接受过术后化疗的患者［17］。这可能与疾病的病程、严重程度及基础状态有关。DM对患者一般情况、免疫水平、化疗反应以及疾病恢复能力造成负面影响，从而引起CRC患者抗肿瘤治疗的不足。本研究中，DM与非DM小鼠均来自体重相近的健康小鼠，肿瘤造模的时间一致，疾病的严重程度接近，且我们对造模过程中外界环境因素进行了比较严格的控制，各项操作均在无菌间进行，喂养时保证充足的光照以及相对平稳的温度和湿度。排除了可能因素的干扰，更能说明DM本身对CRC病程和预后的影响。

CRC可有多个部位分布，近、远、直肠在生理上及胚胎起源上均存在不同，发病机制不同，临床表现也各异［17］。DM合并CRC时亦可能同时合并有其他疾病从而掩盖了症状，临床上患者常以非消化系统疾病的症状就诊，就诊时已有21.43%的患者有肿瘤转移的征象［15］。近年来的研究提示的发生部位有由远端向近端发展的趋势，可能与DM患者常合并便秘有关［19］。本研究的结果显示，DM组动物患结直肠癌后，各项症状比非DM组动物表现明显，主要为体重减轻和消化系统功能紊乱，出现肠梗阻、腹泻、腹水等并发症，肝脏转移也较非DM组（CRC组）早和迅速，转移肿瘤体积大，数量多，但肝、肾功能尚在正常范围，推测与观察时间过短有关。同时，由于观察期仅为4周，DM组和非DM组CRC小鼠均未死亡，故尚不能断定DM对CRC死亡率有明显影响。

胰岛素是一种较弱的促生长因子，能够促进细胞的有丝分裂从而加速细胞增殖、抵抗细胞凋亡。有学者认为降糖药物可以通过对胰岛素水平的调节从而影响肿瘤的发生，任何增加胰岛素水平（内源性/外源性）的治疗都有可能增加患肿瘤的风险［20］。我们认为目前此项理论尚无明确的证据支持，且肿瘤发生的风险与血糖的控制水平呈正相关。在下一步的研究中，我们将延长观察时间，同时对动物血清细胞因子（如胰岛素样生长因子-Ⅰ、血管内皮生长因子-c等）进行监测，并辅以一定的药物治疗，以进一步探寻DM影响CRC预后的相关机制，为临床预后判断提供更为精准的信息。

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［中图分类号］R735

［文献标识码］A

［文章编号］2096-1782（2016）02-0055-04

收稿日期：（2015-11-16）

［作者简介］刘虹（1980-），女，湖南株洲人，本科，副主任医师，主要从事胃肠道肿瘤治疗，lhpetrel@163.com。

The Effects of Diabetes on Straight Colon Cancer Survival and Prognosis of Mice

LIU Hong，GONG Zhijun，QING Duju，LI Enjiu，LIFei
Department of gastrointestinal surgery，Jiangmen Central Hospital，Jiangmen，Guangdong 529000

［Abstract］Objective To explore the effects of diabetes on straight colon cancer survival and prognosis of mice.Methods Sixty mice were randomly divided into 3 groups（each group was 20）.A:Colorectal Cancer Group；B:Diabetes，colorectal cancer group；C:control group.Mice in B group were abdominal injection of alloxan to set up hyperglycemia model.Colon cancer cell lines mice CT26 was cultured in vitro to logarithmic phase，prepared the single cell suspension，and subcutaneous injection to the mice of A and B group.Mice in C group were subcutaneous injection of saline.The survival time，weight and complications（intestinal obstruction，intestinal adhesion，bloody ascites，etc）were observed.Four weeks after the models were successful，mice were executed，and urea nitrogen，creatinine，alanine aminotransferase and aspertate aminotransferase of venous blood were tested to evaluate the function of liver and kidney.Anatomy and gross observation the growth and infiltration of the subcutaneous tumor，pathology check to explicit whether there were liver metastasis and number of metastases.Results All mice were weighed before death，the body mass was［（15.38±3.39）g］and［（14.65±2.59）g］. Compared with before the model［（19.23±0.25）g VS（21.15±0.33）g］，the differences were statistically significant（P＜0.05），and there was no statistical significance between the 2 groups（P＞0.05）.The liver and kidney function of three groups of mice has no obvious change compared with before modeling.The subcutaneous tumor size at the injection site of A and B group was significantly larger than they did before modeling，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.And the volume of group B was greater than the group A.Conclusion Diabetes can promote tumor growth and metastasis of colorectal cancer，increases the incidence of complications and there severity，and may increase mortality.

［Key words］Diabetes；Colorectal cancer；Mice；Complication；Prognosis