谷跗线螨精氨酸激酶基因的克隆及序列分析

赵学影，杨小迪，邬玉兰，刘志刚，孙　新



谷跗线螨精氨酸激酶基因的克隆及序列分析

赵学影1，杨小迪1，邬玉兰2，刘志刚2，孙新1

1．蚌埠医学院，蚌埠233030；;2．深圳大学医学院，深圳518060

摘要：目的揭示谷跗线螨Tarsonemus granarius体内存在泛变应原精氨酸激酶(arginine kinase，AK)。方法从空调滤网灰尘中采集谷跗线螨(约6 000只)并提取总RNA，反转录为cDNA，设计简并引物，PCR克隆谷跗线螨AK片段，采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性。结果测序和序列分析结果表明，谷跗线螨AK基因的开放阅读框由724个碱基组成，其编码的蛋白相对分子质量约为26 019，等电点为10.10。结论成功克隆了谷跗线螨AK基因，为进一步谷跗线螨AK蛋白的重组表达以及过敏原性分析奠定基础。

关键词：谷跗线螨；精氨酸激酶；基因克隆；序列分析

尘螨过敏性哮喘等变态反应性疾病是临床上的常见病、多发病[1]。实验表明，利用粉尘螨过敏病人的血清IgE为探针做免疫组化染色，可诱发人体IgE抗体的变应原，主要分布于螨消化道、腺体及体壁等部位[2]。

精氨酸激酶(AK)广泛存在于无脊椎动物如昆虫、甲壳动物和软体动物体内，是无脊椎动物能量代谢最重要的酶类之一，为其生命活动提供能量，并维持体内ATP的平衡[3-4]。另外，AK在昆虫免疫反应方面也发挥着重要作用[5-9]，而对于谷附线螨过敏原蛋白与基因克隆方面的研究国内外尚未见报道，特以谷跗线螨为实验材料进行研究，

1材料与方法

1.1试螨与试剂

1.1.1供试螨类活螨系从深圳大学学生宿舍分体挂壁式空调出风口滤网灰内采样，将空调滤网取下，用刷子将滤网中的灰尘轻轻地刷至托盘中，在连续变倍体视显微镜下从灰尘中挑取并分离后经形态鉴定为谷跗线螨，用无菌水充分洗涤虫体，滤纸吸干水分，液氮中冻存，备用。

1.1.2实验菌种与载体大肠杆菌E.coliTop10由深圳大学过敏反应与免疫学研究所保存；pMD18-T 载体为Takara公司产品。

1.1.3主要的试剂和试剂盒RNA提取试剂盒购自Qiagen公司；AMV First Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司；质粒小量提取试剂盒[plasmid mini kitⅠ(100)]、琼脂糖凝胶回收试剂盒[gel extractionkit(50)]和DNA胶纯化试剂盒购自OMEGA公司；Ex-Taq酶、T4连接酶以及DNA Marker(DL2000)均购自Takara公司。

1.2简并引物设计从SWISS-PROT 和TrEMBL(www.expasy.org)以及NCBI( www.ncbi.nlm.nih.gov)的GenBank 等数据库下载接近物种的AK基因的mRNA序列，利用分析软件进行对比，选取同源性高的保守区域，根据这些区域设计并合成简并引物。上游引物：AK-F: 5′ATGGTBGAYSCHGC 3′，下游引物：AK-R: 5′TTACAKBGABTTYTCMATCTT 3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3总RNA的提取和精氨酸激酶基因的RT-PCR扩增将采集的谷跗线螨约6000只，放在液氮中用研磨棒充分研磨后，转入RNase Free离心管中，依照Qiagen公司RNA提取试剂盒说明书，按步骤提取谷跗线螨总RNA。按照Fermentas公司的AMV First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明书进行cDNA第一链的合成。以反转录获得的cDNA第一链产物中取2 μL为模板进行PCR 反应，克隆精氨酸激酶基因。反应体系为50 μL：10×buffer 5 μL，10 ×dNTP 4 μL，ddH2O 39.75 μL，引物AK-F为0.5 μL，引物AK-R为2 μL，0.25 μL Ex-Tag 酶。PCR反应程序为：95 ℃ 3 min 后用Touchdown方式进行扩增，第一个循环为94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，此后每个循环的退火温度下降1 ℃，当退火温度下降到50 ℃ 时，则以94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s运行30个循环，再于72 ℃延伸10 min结束。扩增产物电泳分离检测，并切胶回收。

1.4RT-PCR产物克隆和测序回收纯化的RT-PCR 产物与pMD18-T simple Vector进行连接，用氯化钙法将连接产物转入E.coliTop10克隆菌中。用含氨苄青霉素(Amp)的LB平板进行抗氨苄筛选，挑取阳性菌落(含重组质粒)进行菌落PCR验证。对阳性菌落进行过夜摇菌并提取其质粒，将阳性菌落进行序列测定(由上海生工完成)。

1.5序列分析将测序所得序列通过GenBank进行序列比对，并对该蛋白质的等电点和相对分子质量利用在线程序Compute pI/Mw too(http:/ /www.expasy.org/ tools/pi_tool.html)进行评估。利用在线程序CLUSTAL W(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/)将所得克隆进行序列分析。

2结果

2.1AK基因的PCR扩增以提取的谷跗线螨总RNA为模板，采用AMV First Strand cDNA Synthesis Kit将总RNA转录成cDNA后，以谷跗线螨的cDNA为模板，用简并引物进行PCR扩增。扩增的产物经琼脂糖凝胶电泳(图1)，在723 bp左右有一亮带。

Lane M: DNA standard markers;

2.2AK基因阳性克隆的鉴定回收RT-PCR产物，并与pMD18-T Vector连接后转化E.coliTop 10。从平板中挑取白色菌落进行菌落PCR鉴定(图2)，选取阳性菌落进行序列测定。

图2谷跗线螨AK cDNA阳性克隆的菌落PCR鉴定

Fig.2Colony PCR identification of the positive clones containedT.granariuscDNA

2.3序列分析克隆得到的谷跗线螨AK基因(图3)的开放阅读框由724个碱基组成，其编码的蛋白相对分子质量约为26 019，等电点为10.10。

图3　谷跗线螨AK的核酸序列

3讨论

近几十年来，全球变态反应性疾病的发病率逐年升高，成为危害人类健康的主要问题之一。全球过敏性疾病发病率约15%～30%，主要有过敏性哮喘、过敏性鼻炎和过敏性胃肠炎等。过敏反应性疾病是由于人体吸入、食用或接触变应原引起的。其中，尘螨是最常见的吸入性变应原之一。有关螨过敏反应方面的报道，大多集中在屋尘螨和粉尘螨过敏原的研究上，对这两种螨过敏原及分子方面的研究已有很多[10-12]。而对谷跗线螨的研究报道较少，对其过敏原蛋白和基因克隆方面的研究国内外也未见报道。

精氨酸激酶广泛存在于无脊椎动物如昆虫、软体动物和甲壳动物体内，是一种对能量代谢、贮藏和利用起重要调节作用的磷酸原激酶，这已在烟夜蛾等多种昆虫中得到广泛证实[13-14]。本研究采用RT-PCR方法，克隆得到了谷跗线螨的精氨酸激酶基因，证实谷跗线螨体内存在精氨酸激酶基因。研究发现，精氨酸激酶基因可以在昆虫的多种组织中表达，但在不同组织内表达量差异较大。比如，意大利蜜蜂的ArgK基因在脑、触角、复眼和胸部内均有表达，但在复眼的表达量最高[15]。家蚕的BmAK基因在腹足、脂肪体、表皮、中肠、丝腺中都有表达，其中在腹足中表达量最高，其次是脂肪体[13]。烟夜蛾的HassAK基因在幼虫头部、中肠、脂肪体、体壁和腹足中均可表达，其中以腹足和中肠的表达水平较高[14]。而精氨酸激酶基因在谷跗线螨体内的表达情况如何，有待进一步探明。

精氨酸激酶在昆虫免疫反应方面发挥重要作用，直接或间接参与相关的免疫反应。研究发现，精氨酸激酶在诱导贝类源性过敏性疾病中发挥着重要作用[8]。德国小蠊、美洲大蠊等的精氨酸激酶为蜚蠊主要致敏原之一，可以诱发人类的一些过敏性反应[16]。精氨酸激酶也是家蚕的主要致敏原之一[17]。并发现在无脊椎动物如尘螨、蟑螂、龙虾、贝等物种中存在IgE交叉反应的同源性[9]。前期实验结果表明[2]，利用粉尘螨过敏病人的血清IgE为探针做免疫组化染色，可见谷跗线螨体内存在可诱发人体IgE抗体的变应原，主要分布于螨消化道、腺体及体壁等部位，提示谷跗线螨可诱发敏感患者产生IgE抗体。对分布于谷跗线螨这些部位的变应原是否是精氨酸激酶，有待于进一步研究证实。

此外，精氨酸激酶有可能成为新的害虫防治的潜在靶点，因为精氨酸激酶是无脊椎动物体内不可缺少的、调节能量代谢的关键酶，且仅存在于无脊椎动物体内，其参与的代谢途径与哺乳动物体内肌酸激酶参与的途径不同；而传统的化学农药的使用又给环境和人类健康带来不容忽视的影响，因此寻求新的害虫防治手段具有重要意义。据研究报道，利用RNAi技术敲低家蝇幼虫精氨酸激酶的表达后，可影响家蝇的生长发育，并能有效杀死家蝇，不会影响其他生物的正常和发育，具有较高的安全性[4]。随着空调使用的普及，螨性哮喘发病率也呈上升趋势，谷跗线螨作为我国南方地区空调滤网灰尘中的优势螨种之一，借助空调送风已成为螨抗原一种新的、重要的传播方式，寻找新的螨虫防治手段势在必行。

参考文献：

[1]Global Initiative for Asthma. GINA Report, Global Strategy for Asthma Management and Prevention[EB/OL].(2015-04-01)[2015-06-03])http://www.ginasthma. org/guidelinesgina-report-global-for-asthma.html.

[2]Zhao XY, Zhao ZF, Sun X, et al. Localization of cross-reactivity allergens in the body ofTarsonemusgranaries(Acari:Tarsonemidae) by immunohistochemistry[J]. Acta Entomologica Sinica, 2011, 54 (7): 848-852. (in Chinese)

赵学影, 赵振富, 孙新, 等. 谷跗线螨交叉反应性变应原的定位[J]. 昆虫学报, 2011, 54 (7): 848-852.

[3]Perovic-Ottstadt S, Wiens M, Schroder HC, et al. Arginine kinase in the demospongeSuberitesdomuncula: regulation of its expression and catalytic activity by silicic acid[J]. J Exp Biol, 2005, 208: 637-646. See comment in PubMed Commons below

[4]Yu X, Cao XR, Gao YF, et al. Cloing of arginine kinase gene from the houseflyMuscadomesticaand its application in pest control[J].Hebei Univ(Nat Sci Edi), 2015, 35(1), 70-75.

于雪, 曹新茹, 高一夫, 等. 家蝇精氨酸激酶基因克隆及其在害虫防治上的应用[J]. 河北大学学报, 2015, 35(1), 70-75.

[5]Chen YK, Wu YL, Li L, et al. Cloning, expression and purification of arginine kinase fromLocustamigratoriamanilensisand its allergic activity[J]. Chin J Appl Entomol, 2013. 50(2): 133-138. (in Chinese)

陈义昆, 邬玉兰, 李荔, 等. 东亚飞蝗主要过敏原精氨酸激酶基因的克隆表达、纯化及免疫原性鉴定[J]. 应用昆虫学报, 2013, 50(2): 133-138.

[6]Sookrung N, Chaicumpa W, Tungtrongchitr A, et al.Periplanetaamericanaarginine kinase as a major cockroach allergen among Thai patients with major cockroach allergies[J]. Environ Health Perspect, 2006, 114(6): 875-880.

[7]Heng LC, Hai YM, Min JC, et al. Purification, physicochemical and immunological characterization of arginine kinase, an allergen of crayfish(Procambarusclarkii)[J]. Food Chem Toxicol, 2013, 62: 475-484.

[8]Rahman AMA, Kamath SD, Lopata AL, et al. Identification of hemocyanin as a novel non-cross-reactive allergen from the giant freshwater shrimp[J]. Mol Nutrit Food Res, 2011, 55: 1492-1498.

[9]Binder M, Mahler V, Hayek B, et al. Molecular and immunological characterization of arginine kinase from the Indianmeal moth,Plodiainterpunctella, a novel cross-reactive invertebrate pan-allergen[J]. J Immunol, 2001, 167: 5470-5477.

[10]Chen DX, Zhou PK, Ran PX, et al. Screening and identification of dominant allergens ofDermatophagoidespteronyssinusandDermatophagoidesfarina[J]. China Trop Med, 2009, 9(2): 232-234. (in Chinese)

陈代雄, 周平坤, 冉丕鑫, 等. 屋尘螨和粉尘螨主要变应原的筛选和分析[J]. 中国热带医学, 2009, 9(2): 232-234.

[11]Liu ZG, Yang H, Fu YY, et al. Purification and immunogenicity analysis of the recombinant allergen Der p 1 fromDermatophagoidespteronyssinus[J]. J Trop Med, 2006, 6 (6): 656-659. (in Chinese)

刘志刚, 杨慧, 付颖媛, 等. 屋尘螨变应原Der p 1基因原核表达产物的纯化及特性鉴定[J]. 热带医学杂志, 2006, 6(6): 656-659.

[12]Zhu JQ, Liu ZG, Gao B, et al. Cloning, expression, and purification of Der f Ⅰ gene and its immunological characteristics[J]. Acta Entomologica Sinica, 2006, 49(2): 213-218. (in Chinese)

朱健琦, 刘志刚, 高波, 等. 粉尘螨Ⅰ类变应原(Der f Ⅰ)的克隆表达、纯化及免疫学特性[J]. 昆虫学报, 2006, 49(2): 213-218.

[13]Wang HB, Xu YS. cDNA cloning, genomic structure and expression of arginine kinase gene fromBombyxmori[J]. Sci Agric Sin, 2006, 39(11): 2354-2361. (in Chinese)

王华兵, 徐豫松. 家蚕精氨酸激酶基因的克隆、基因结构与表达分析[J].中国农业科学, 2006, 39(11): 2354-2361.

[14]Zhang YC, An SH, Li WZ, et al. Cloning and mRNA expression analysis of arginine kinase gene fromHelicoverpaassulta(Guenee) (Lepidoptera: Noctuidae)[J]. Acta Entomologica Sinica, 2011, 54 (7):754-761. (in Chinese)

张元臣, 安世恒, 李伟争, 等. 烟夜蛾精氨酸激酶基因的克隆及mRNA表达分析[J]. 昆虫学报, 2011, 54 (7): 754-761.

[15]Kucharski R, Maleszka R. Arginine kinase is highly expressed in the compound eye of the honey bee,Apismellifera[J]. Gene, 1998, 211(2): 343-349.

[16]Yan H, Xia LX, Chen JJ, et al. Cloning, Expression and purification of arginine kinase fromBlattellagermanicaand its immune[J]. Chin J Parasitol Parasit Dis, 2011, 29(3): 191-194. (in Chinese)

闫浩, 夏立新, 陈家杰, 等. 德国小蠊精氨酸激酶基因的克隆、表达及免疫活性测定[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2011, 29(3): 191-194.

[17]Liu ZG, Xia LX, Wu YL, et al. Identification and characterization of an arginine kinase as a major allergen from silkworm (Bombyxmori) larvae[J]. Int Arch Allergy Immunol, 2009, 150(1): 8-14.

DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.02.009

通讯作者：刘志刚，Email：lzg195910@126.com；

Corresponding authors: Liu Zhi-gang, Email: lzg195910@126.com; Sun Xin, Email: sunxin@bbmc.edu.cn

中图分类号：R384

文献标识码：A

文章编号：1002-2694(2016)02-0148-04

收稿日期：2015-06-03；修回日期:2015-08-29

Cloning and sequence analysis of the arginine kinase genes in Tarsonemus granarius (Acari: Tarsonemidae)

ZHAO Xue-ying1,YANG Xiao-di1,WU Yu-lan2,LIU Zhi-gang2,SUN Xin1

(1.Bengbu Medical College, Bengbu 233030, China;2.MedicalCollegeofShenzhenUniversity,Shenzhen518060,China)

Abstract:In order to clarify that the pan-allergen arginine kinase (AK) gene was existed in the body of Tarsonemus granaries, the live mites (about 6 000) were collected from the air conditioning filter, identified as T. granarius. The total RNA was extracted. The cDNA of AK was cloned, using degenerate primers, from the total RNA of T. granarius. The encoded protein characteristics was analyzed by bioinformatics software. The results of sequencing and sequence analysis showed that the full-length open reading frame of cloned cDNA contained 724 bp and the estimated molecular mass was 26 019(pⅠ10.10). It is concluded that AK was successfully obtained, which will be used for the further recombinant expression and allergenic analysis of T. granarius.

Keywords:Tarsonemus granarius; arginine kinase; gene cloning; sequence analysis

国家自然科学基金(No.81071388)资助

孙新，Email：sunxin@bbmc.edu.cn

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81071388)