SSR标记在糯玉米品种鉴定上的应用

张振良++郝德荣++陈国清++陆虎华+石明亮+冒宇翔++吴嘉点+黄小兰+程玉静+周广飞++薛林

摘要：采用NY/T 1432—2014《玉米品种鉴定技术规程SSR标记法》中的20对简单重复序列（SSR）引物对市场上抽检的苏玉糯11、苏玉糯901、苏玉糯13、苏玉糯14、苏玉糯639等5个糯玉米品种进行真实性鉴定。结果表明，每个抽检品种与标准品种至少有6个差异位点，这5个品种均与相应的标准品种不同；此外，umc1545y2、umc1335y5、umc2105k3、umc1705w1、umc1125y3、umc2007y4、phi053k2、bnlg2305k4等8对引物多态性较好，在今后糯玉米品种鉴定中可优先采用。

关键词：糯玉米；SSR标记；品种；鉴定；应用

中图分类号： S513.03文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）06-0104-02

收稿日期：2015-05-15

作者简介：张振良（1987—），男，山东东平人，硕士，研究实习员，研究方向为玉米分子遗传和育种。E-mail：zhenliang1110@163.com。

通信作者：薛林，研究员，研究方向为玉米育种。E-mail：417803648@qq.com。糯玉米因其营养丰富、风味独特、适口，越来越受到广大消费者欢迎。糯玉米种植面积越来越大，品种数量逐年上升，品种真实性鉴定需求也急剧增加。糯玉米育种中由于少数骨干亲本的集中应用，造成品种间遗传基础狭窄，仅从形态上鉴定存在一定困难，给玉米品种的生产、经营、使用以及种子管理部门的监督带来一定挑战。随着DNA指纹图谱技术的发展，以简单重复序列（SSR）为代表的分子标记技术逐渐成熟并应用于农业种子生产研究和种子质量管理[1-2]。2014年，中国农业部公布了一系列主要农作物品种鉴定的行业标准，如NY/T 1432—2014《玉米品种鉴定技术规程SSR标记法》、NY/T 1433—2014《水稻品种鉴定技术规程SSR标记法》，代替了2007年公布的行业标准，使SSR标记技术对农作物品种真实性鉴定的方法更加完善和准确。为进一步明确SSR标记在糯玉米品种真实性鉴定中的作用，本研究采用NY/T 1432—2014《玉米品种鉴定技术规程SSR标记法》标准鉴定5个疑似套牌糯玉米杂交种的真实性，同时探讨SSR分子标记技术在糯玉米品种真实性鉴定中的应用前景。

1材料与方法

1.1材料

市场上抽检的苏玉糯11、苏玉糯901、苏玉糯13、苏玉糯14、苏玉糯639等5个糯玉米品种，疑是套牌种子依次编号为A、B、C、D、E，标准品种分别编号为A1、B1、C1、D1、E1。其中套牌种子由种子管理部门提供，标准品种由江苏沿江地区农业科学研究所玉米室提供。分别对每个样品（品种）的5个个体单独进行分析。

1.2DNA提取

取约0.2 g玉米幼嫩叶片于液氮中研磨，转入2 mL离心管中，加入800 μL预热65 ℃的CTAB提取缓冲液，混匀，水浴60 min，每隔10 min小心摇动离心管；取出离心管，待冷却至25 ℃，加入800 μL三氯甲烷 ∶ 异戊醇（24 ∶ 1），小心充分摇动试管至有机相呈深绿色，室温下于8 000 r/min离心 10 min；用剪口的1 mL枪头将上清液转移到另一离心管中，加入2/3体积预冷的异丙醇（-20 ℃），小心混匀；8 000 r/min 离心 2 min，弃上清液，用5 00 μL 70%乙醇清洗2次，弃上清液，干燥沉淀，加150 μL TE溶解。

1.3PCR扩增

根据NY/T 1432—2014《玉米品种鉴定技术规程SSR标记法》标准，选用bnlg439w1、umc1335y5、umc2007y4、bnlg1940k7、umc2105k3、phi053k2、phi072k4、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg2305k4、bnlg161k8、bnlg1702k1、umc1545y2、umc1125y3、bnlg240k1、phi080k15、phi065k9、umc1492y13、umc1432y6、umc1506k12等20对SSR标记，均匀分布在玉米10对染色体上。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系（10 μL）为：1 μL 模板DNA （100～150 ng），上、下游引物（10 μmol/L）各0.2 μL、1 μL 10×Taq buffer、0.7 μL MgCl2、0.8 μL dNTP（2.5 mmol/L）、DNA Polymerase（2.5 U/μL）0.2 μL（TIANGEN），其余以超纯水补足至所需体积。反应液上加盖15 μL石蜡油，以防反应过程中水分蒸发。PCR程序为： 94 ℃，5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共31个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃恒温冷藏。

1.4非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及显色。

PCR产物用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色。

1.5品种真实性鉴定标准

从样品中随机抽取5个单株作为检测样本。根据抽检样本电泳谱带和标准品种电泳谱带的一致性鉴定品种的真实性。结果按照农业部颁布的行业标准NY/T 1432—2014《玉米品种鉴定技术规程SSR标记法》判定。当样品间差异位点数≥2，判定为不同；当样品间差异位点数=1，判定为近似；当样品间差异位点数=0，判定为极近似或相同。

2结果与分析

2.1糯玉米杂交种DNA检测

对提取的糯玉米基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图1。结果表明，提取的玉米基因组DNA主带清晰一致，适合进一步的SSR分析。

2.2品种内遗传一致性分析

20对引物中有umc1125y3、bnlg161k8、umc1506k12等3对引物在品种内发生变异，均发生在抽检的苏玉糯13、苏玉糯14、苏玉糯639中，且都属于在5个单株检测重复中只发现1个不一致的情况（图2）。20对引物对10个糯玉米杂交种的200次扩增中，出现了共计5次品种内变异，占2.5%，说明品种内变异较小，电泳谱带比较结果是可靠的。

2.3糯玉米SSR鉴定分析

对抽检的5个糯玉米杂交种和标准品种电泳谱带比较可知，抽检的苏玉糯11与标准品种相比有11个差异位点，占引物总数的55%；苏玉糯901与标准品种相比有7个差异位点，占引物总数的35%；苏玉糯13与标准品种相比有6个差异位点，占引物总数的30%；苏玉糯14与标准品种相比有9个差异位点，占引物总数的45%；苏玉糯901与标准品种有6个差异位点，占引物总数的30%（表1）。按照农业部颁布的行业标准NY/T 1432—2014《玉米品种鉴定技术规程 SSR标记法》，可判定待检测的5个抽检样品与相应的标准品种为不同品种。

2.4引物多态性分析

umc1545y2在5个品种鉴定中均为差异位点（图3），umc1335y5、umc2105k3、umc1705w1、umc1125y3在4个品种中均检测到差异位点，umc2007y4、phi053k2、bnlg2305k4、bnlg1702k1 在3个品种中均检测到差异位点（表1）。上述差异位点均在多个抽检品种与标准品种间检测到，说明这些位点多态性较高。

3结论与讨论

SSR分子标记为共显性遗传，反映的是具体DNA片段的大小，既不受组织器官及发育阶段的影响，也不受季节和环境因素的制约，与传统田间种植鉴定相比，是一种更加快速、准确鉴定品种真实性的方法，广泛应用于种质资源分析和农作物品种鉴定[3-7]。本研究采用SSR标记对市场上抽检的5份糯玉米品种进行鉴定，结果表明，抽检的5个糯玉米品种均与相应的标准品种不同，与田间鉴定结果一致，说明SSR标记鉴定结果可靠准确。

引物筛选是SSR标记鉴定品种真实性的关键，选用多态性高、染色体上分布均匀、稳定性好的引物可有效提高工作效率、降低成本[7-8]。本研究采用农业部公布的NY/T 1432—2014《玉米品种鉴定技术规程SSR标记法》中的前20对引物，这20个SSR位点的带型清晰、稳定性较好，平均分布在玉米的10条染色体上，其中有9对引物在至少3个糯玉米品种中检测出差异位点，说明这9对引物在糯玉米品种中多态性较好，在今后糯玉米品种鉴定中可优先采用，以减少工作量、降低成本。

由于剩余遗传效应作用，品种内变异普遍存在，品种内变异导致品种内不同个体之间重复带型不一致，在品种真实性鉴定中会干扰判断[3]。为避免糯玉米品种内产生遗传变异造成的误差，本研究对每份糯玉米杂交种均采用5个单株重复。结果表明，20对引物只有3对引物发生品种内变异，且5个单株检测重复中只发现1个不一致情况，属于可控范围内。针对品种内重复性差的样品，则需要扩大检测样品的重复次数。

品种真实性鉴定作为种子生产和种子检验的重要环节，应得到种子管理部门的高度重视。SSR标记因其多态性高、重复性强的特点已被农业部确定为品种真实性鉴定的有效方法。SSR分子标记技术在种子管理工作中应充分发挥作用，一方面应用于市场糯玉米种子质量监督抽查，以阻止套牌侵权品种上市流通，保障农民合法权益；另一方面应用于糯玉米品种审定区域试验，以维护区试工作中的公正、公平，维护育种单位以及广大种子生产者的利益。

参考文献：

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