白藜芦醇抗乙型肝炎病毒及肝炎所致纤维化的初步研究

罗宏伟，张四喜

(1.唐山市传染病医院 七病区，河北 唐山 063000；2.吉林大学第一医院 检验科，吉林 长春 130000)

白藜芦醇抗乙型肝炎病毒及肝炎所致纤维化的初步研究

罗宏伟1，张四喜2Δ

(1.唐山市传染病医院 七病区，河北 唐山 063000；2.吉林大学第一医院 检验科，吉林 长春 130000)

目的 初步研究白藜芦醇抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)及肝纤维化的作用。方法 采用rAAV8-1.3HBV腹腔注射新生SD大鼠建立大鼠HBV感染模型，建模成功后将大鼠随机分为4组，每组5例，即阴性对照组、白藜芦醇低剂量组、白藜芦醇高剂量组、阳性对照组，分别给予生理盐水、20 mg/kg白藜芦醇、40 mg/kg白藜芦醇、0.1 mg/kg阿昔洛韦灌胃。2、4、8、12周后尾静脉采血检测乙肝表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎E抗原(HBeAg)、乙肝病毒的脱氧核糖核酸(HBV-DNA)。建立HSC-T6细胞模型，分别以生理盐水、白藜芦醇灌胃大鼠制备对照组及白藜芦醇血清，采用AlamarBlue法观察白藜芦醇血清对HSC的增殖作用，RealtimePCR法分析白藜芦醇血清对HSC细胞I型胶原及TGF-β1 mRNA表达的影响。Western Blot法分析白藜芦醇血清对HSC细胞I型胶原及TGF-β1蛋白表达的影响。结果 采用ELISA法检测HBsAg、HBeAg、HBV-DNA发现第2周、第4周阴性对照组HBsAg、HBeAg的表达明显高于其余3组P<0.05，其中第2周对照组HBsAg、HBeAg的表达最高分别为(4118±367)IU/mL、(160.2±56.90)IU/mL。而HBV-DNA则在第2周阴性对照组与其余3组相比具有明显差异P<0.05。AlamarBlue法结果白藜芦醇血清可抑制HSC-T6增殖，Realtime PCR结果白藜芦醇血清可以显著抑制HSC-T6的I型胶原及TGF-β1 mRNA表达。Western blot结果显示白藜芦醇血清可以显著抑制HSC-T6的I型胶原及TGF-β1蛋白表达。结论 白藜芦醇能抑制HBV同时通过抑制I型胶原及TGF-β1达到阻止肝纤维化的结果。

白藜芦醇；HBV；I型胶原；TGF-β1

白藜芦醇是一种多酚类小分子化合物，存在于多种植物中，如虎杖、葡萄、桑葚等[1]。研究发现白藜芦醇具有抗心血管疾病、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒等作用[2-4]。近年来白藜芦醇在抗肝炎病毒方面的研究[5-6]，更是为中药治疗肝炎拓展了空间。但是大部分的报道尚停留在细胞层面，体内实验研究较少，更没有乙肝病毒对肝炎后肝硬化的影响报道。本实验采用rAAV8-1.3HBV注射法建立大鼠模型，进而研究白藜芦醇对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)及肝纤维化的影响。HBV感染过程及肝纤维化形成更贴近人类。同时为白藜芦醇的抗乙肝病毒研究提供了新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 rAAV8-1.3HBV，北京五加和分子医学研究所提供；SPF级SD新生鼠仔(合格证号SCXK(冀)2008-16)，北京维通利华实验动物技术有限公司；乙肝表面抗原(HBsAg)、HBeAg ELISA试剂盒，武汉伊莱瑞特生物科技有限公司；乙肝病毒的脱氧核糖核酸(HBV-DNA)定量检测试剂盒，上海酶联生物科技有限公司；白藜芦醇，Sigma-Aldrich；HSC-T6，购自上海中医药大学；RealTime PCR试剂盒，上海远慕生物科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒，碧云天生物科技有限公司；Col I、TGF-β1抗体，Oncogene公司；AlamarBlue试剂盒，上海前尘生物科技有限公司。

β-actin、Col I、TGF-β1由上海生工生物工程技术公司设计合成：

β-actin： Forward :TGACGAGGCCCAGAGCAAGA

Resverse:ATGGGCACAGTGTGGGTGAC

Col I：Forward :ACTCAGCCGTCTGTGCCTCA

Resverse:GGAGGCCTCGGTGGACATTA

TGF-β1：Forward :AATTCCTGGCGTTACCTTGGT

Resverse:GAGGGTCGGTTACTGTCATG

1.2 方法

1.2.1 乙肝大鼠模型的建立：按照孙潇[7]的方法建立大鼠乙肝模型，首先选取SPF级SD新生鼠仔，采用腹腔注射1×1011拷贝数rAAV8-1.3HBV，即217 μL/只，建立大鼠乙肝模型，阴性对照组选三只大鼠给予相同体积的PBS腹腔注射。2周后采用ELISA检测大鼠血清中HBsAg、乙型肝炎E抗原(HBeAg)。结果阳性者模型建立成功。选取造模成功的20只大鼠随机分成4组，每组5例。白藜芦醇低剂量组给予20 mg/kg白藜芦醇，2次/天灌胃，白藜芦醇高剂量组给予40 mg/kg白藜芦醇，一天两次灌胃，阳性对照组给予阿昔洛韦(扬子江药业，H20046139)0.1 mg/kg，2次/天灌胃。阴性对照组给予等量的蒸馏水2次/天灌胃。分别在2、4、8、12周尾静脉采血检测HBsAg、HBeAg、HBV-DNA情况。

1.2.2 白藜芦醇对HSC细胞I型胶原及TGF-β1表达的影响：

① 实验分组：将20只SPF级SD新生鼠仔随机分为2组，每组10例，对照组给予1 mg/100 g生理盐水灌胃，白藜芦醇组给予40 mg/kg灌胃，2次/天，连续给药一周后，进食12 h，次日断头取血，收集2组血清后于56 ℃水浴灭活30 min，分装，-70 ℃备用。本实验的实验过程严格遵守《实验动物保护条例》

② 白藜芦醇血清抑制细胞增殖试验：采用AlamarBlue法检测血清抑制细胞增殖。将上述收集的对照组及白藜芦醇组血清分为含10、20、40%血清各3组。每个浓度的组别均有细胞组、对照组、背景组，每组6个复孔。调整HSC-T6细胞悬液为1×105/mL。按100 μL/孔接种到96孔板中，细胞培养，白藜芦醇组添加不同浓度的对照组/白藜芦醇组血清及AlamarBlue液10 μL/孔。对照组无细胞但添加与白藜芦醇组相同的DMEM和血清，并与白藜芦醇组相同的时间点加入AlamarBlue液。背景组添加与对照组相同的DMEM和血清，但不加AlamarBlue液。上述各组置于37 ℃、5%的CO2培养箱中在2、4、8、16、24 h时测波长在570 nm及595 nm的各孔吸光度。计算Reduced AB=(117.2×A570(细胞组-背景组)-80.5×A595(细胞组-背景组))/(155.7×A595(对照组-背景组)-14.6×A570(对照组-背景组))

③ PCR检测I型胶原及TGF-β1表达：用含有10%对照组大鼠血清/白藜芦醇大鼠血清的DMEM孵育HSC-T6细胞24 h，收集细胞后用Trizol提取总RNA。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA，并取1 μL RNA和99 μLDEPC加入96孔板中，多功能酶标仪于260 nm、280 nm测(A260/280)，计算RNA纯度。

取4 μg RNA，加random hexamer primer(0.2 μg/mL)1 μL，DEPC水补充体积至12 μL，70 ℃火浴5 min后，加入5×reactin buffer 4 μL、Ribonuclease inhibitor(20 μ/μL)1 μL、10 mM dTNPmix 2 μL，25 ℃火浴5 min，再加入Revert Aid M-uLVRT(200 μ/μL)1 μL，终体系为20 μL。25 ℃火浴10 min后42 ℃火浴60 min，最后72 ℃火浴10 min，最终反转录成cDNA。之后94 ℃变性15 s，57 ℃退火20 s，68 ℃延伸30s，进行RealTimePCR扩增。2%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，整体反应进行3次。

④ Western blot：与上一步骤相同方法孵育HSC-T6细胞24 h，收集细胞后采用细胞裂解液裂解细胞，离心后取上清。BCA法测定上清液总蛋白含量，取含30 μg总蛋白的上清液进行10% SDS-PAGE电泳，经硝酸纤维素膜转移，5%脱脂牛奶TBS-T封闭后，分别与I型胶原、TGF-β1抗体孵育，PBS洗涤，在与HRP偶联的第二抗体作用，反应信号与ECL底物化学发光检测。

2 结果

2.1 血清中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA的检测情况 经rAAV8-1.3HBV造模后的大鼠，2 w后采血，图1为HBsAg的检测结果，第二周大鼠血清中阴性对照组的含量最高为(4118±367)IU/mL，阴性对照组与白藜芦醇低剂量组(3352±286)IU/mL、白藜芦醇高剂量组(2981±143)IU/mL、阳性对照组(3121±221)IU/mL相比均具有统计学差异(P<0.05)。其中白藜芦醇的2组与阳性对照组相比没有统计学差异。而白藜芦醇低剂量组与高剂量组相比具有明显的统计学差异(P<0.05)。第4周时阴性对照组的HBsAg(1054±119)IU/mL的含量仍为最高，且与其余3组(白藜芦醇低剂量组(809±81)IU/mL、白藜芦醇高剂量组(668±112)IU/mL、阳性对照组(531±78)IU/mL)相比均具有统计学差异。其中白藜芦醇低剂量组与阳性对照组相比具有统计学差异(P<0.05)。8周后各组间相比没有统计学差异。图2为HBeAg的检验结果。两周时空白对照的HBeAg表达达到了最高为(160.2±56.90)IU/mL。且对照组与其余3组(白藜芦醇低剂量组(124±19)IU/mL、白藜芦醇高剂量组(115±15)IU/mL、阳性对照组(67±16)IU/mL)相比均有统计学差异(P<0.05)，阳性对照组与白藜芦醇低剂量组和高剂量组相比具有统计学差异(P<0.05)。四周时阴性对照组(50±13)IU/mL与白藜芦醇高剂量组(28±11)IU/mL及阳性对照(24±8)IU/mL之间存在差异(P<0.05)。四周后各组间无差异。图3为血中HBV-DNA的检测结果。2周时阴性对照组(3.26×106±5.48×105)IU/mL与其余3组[白藜芦醇低剂量组(0.92×106±0.14×106)IU/mL、白藜芦醇高剂量组(6.39×105±1.08×105)IU/mL、阳性对照组(4.76×105±0.85×105)IU/mL]的比较均有统计学差异(P<0.05)。同时白藜芦醇低剂量组与阳性对照组相比具有统计学差异(P<0.05)。其余时间段以及各组间相比没有统计学差异。

图1 大鼠血中HBsAg含量(n=5)*P<0.05，与阴性对照组相比；#P<0.05，与白藜芦醇高剂量组相比；&P<0.05，与阳性对照组相比Fig.1 Content of HBsAg in rats blood (n=5)*P<0.05，compared with negative control group；#P<0.05，compared with high-dose resveratrol；&P<0.05，compared with positive control group

图2 大鼠血中HBeAg含量(n=5)*P<0.05，与阴性对照组相比；#P<0.05，与阳性对照组相比Fig.2 Content of HBeAg in rats blood (n=5)*P<0.05, compared with negative control group; #P<0.05, compared with positive control group

图3 大鼠血中HBV DNA含量(n=5)*P<0.05，与阴性对照组相比；#P<0.05，与阳性对照组相比Fig.3 Content of HBV DNA in rats blood (n=5)*P<0.05, compared with negative control group；#P<0.05, compared with positive control group

2.2 白藜芦醇血清抑制细胞增殖试验 本实验采用10、20、40%的大鼠血清/白藜芦醇血清的DMEM培养液孵育细胞，结果如图4所示10、20%的血清可明显促进HSC-T6的Reduced AB值增长，40%的血清浓度在8 h后促进作用开始明显。但各浓度在16 h后增殖速度放缓，24 h促进增值的速度有所下降，40%血清浓度的最为明显。故白藜芦醇血清在24 h对HSC-T6细胞的ReducedAB值出现抑制，即白藜芦醇能抑制HSC-T6增殖，所以白藜芦醇能抑制肝纤维化的进展。

图4 白藜芦醇血清对HSC-T6的增殖抑制试验(n=6)Fig.4 Inhibition of Proliferation of HSC-T6 by Resveratrol Serum(n=6)

2.3 PCR检测I型胶原及TGF-β1表达 本实验采用PCR检测I型胶原及TGF-β1表达，见图5，白藜芦醇血清作用于HSC-T6细胞24 h后I型胶原(1.33±0.250)及TGF-β1(1.72±0.520)的表达明显较对照组(3.98±0.72)、(6.22±0.94)减少(P<0.05)。即白藜芦醇能明显抗纤维化。

图5 PCR检测I型胶原及TGF-β1表达(n=10)0：β-actin；1：白藜芦醇组；2：对照组；*P<0.05，与阴性对照组相比Fig.5 Expression of Col I and TGF-β1 by PCR (n=10)0：β-actin；1：Resveratrol group；2：Control group;*P<0.05, compared with negative control group

2.4 Western blot 根据图6所示为Western blot检测I型胶原及TGF-β1表达情况。结果可见白藜芦醇组血清能明显抑制HSC-T6的I型胶原及TGF-β1的表达，与对照组相比具有统计学差异(P<0.05)。

图6 Western Blot检测I型胶原及TGF-β1表达*P<0.05，与阴性对照组相比Fig.6 Expression of Col I and TGF-β1 by Western Blot*P<0.05, compared with negative control group

3 讨论

乙肝是我国的常见传染性疾病，每年政府都投入大量的人力、物力进行乙肝的防治工作。这也使得乙肝研究更加紧迫[8-9]。但是自然状态下只有人及少数的灵长类动物能够被感染[10]，所以合适乙肝的动物模型难以建立。本实验是利用rAAV8病毒载体感染大鼠，从而将乙肝病毒带入大鼠肝细胞内，使病毒能够稳定的复制。模型建立成功后我们对大鼠进行白藜芦醇及生理盐水灌胃，之后观察不同时间点大鼠血中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA的情况。可见前四周HBsAg、HBeAg白藜芦醇组中的HBsAg、HBeAg明显少于阴性对照组，白藜芦醇高剂量组与阳性对照组没有明显的差异。第2周时白藜芦醇可使HBV-DNA减少，与阴性对照组相比具有明显差异。4周后上述3种指标在各组间均未见明显的差异。这主要是因为实验采用的是新生鼠仔随着鼠仔体重的增加，将HBsAg、HBeAg、HBV-DNA稀释导致各组之间差异不明显[11]。

白藜芦醇抗病毒的作用已经被人们所熟知，其主要作用为免疫调节的改变，这也同时为白藜芦醇抗乙肝病毒创造了研究背景[12-15]。通过抗病毒的研究我们已经证实了白藜芦醇的抗乙肝作用，那么白藜芦醇的肝抗纤维化作用，有待于发觉。肝纤维化是慢性HBV感染后结果，主要是由于HSC的活化同时成纤维细胞合成大量细胞外基质。HSC活化后会促进I型胶原及TGF-β1表达增加导致肝纤维化的加重。故HSC、I型胶原和TGF-β1在肝纤维中至关重要。本实验中利用含有白藜芦醇的血清作用于HSC细胞之后通过计算ReducedAB值、PCR及Western blot进一步发现白藜芦醇能够导致HSC表达的I型胶原和TGF-β1减少，进而阻止肝纤维化。所以白藜芦醇能够抑制HBV，同时通过抑制I型胶原和TGF-β1减少阻止肝纤维化。

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(编校：师维康)

Preliminary study of resveratrol on anti - hepatitis B virus and hepatitis induced fibrosis

LUO Hong-wei1, ZHANG Si-xi2Δ

(1.Department of Seven Ward, Tangshan Infectious Disease Hospital, Tangshan 063000 China; 2.Department of Laboratory, the First Hospital of Jilin University, Changchun 130000 China)

ObjectiveTo study the effect of resveratrol on hepatitis B virus (HBV) and hepatic fibrosis.MethodsThe rat model of HBV infection was established by intraperitoneal injection of rAAV8-1.3HBV. After successfully establishing the modle, were randomly divided into four groups: negative control group, resveratrol low dose group, high dose group, positive control group, and five rats in each group. Giving a physiological saline, 20 mg/kg respectively resveratrol, 40 mg/kg, 0.1 mg/kg acyclovir via gastrogavage respectively. 2、4、8、12 weeks later ,we detected the HBsAg, HBeAg, HBV-DNA via tail vein blooding. HSC-T6 cell model was established. Then rats were divided into two groups, control and resveratrol serum group. Each group was administrated with normal sodium and resveratrol via gastrogavage to make serum. The HSC-T6 viability was observed by AlamarBlue assay. The expression of Col I and TGP-β1 mRNA was determined by Realtime PCR. The expressions of Col I and TGP-β1 Protein was analyzed by WesternBlot.ResultsUsing ELISA method to detect HBsAg、HBeAg、HBV-DNA and found that the expression of HBsAg and HBeAg of negative control group were significantly higher than the rest of the three groups (P<0.05) at the second and the fourth week. The highest expression of HBsAg and HBeAg were (4118±367) IU/mL、(160.2±56.90) NCU/mL at the second week. The expression of HBV-DNA of negative control group is significantly higher than the rest of the three groups (P<0.05) at the second week. AlamarBlue assay indicated that different concentration of serum of resveratrol can inhibit HSC-T6 proliferation. Compared with control group, serum with drug resveratrol significantly down-regulated the mRNA and protein expression of Col I and TGP-β1.ConclusionResveratrol inhibits HBV and liver fibrosis by inhibiting type I collagen and TGF-β1.

Resveratrol; HBV; Col I; TGP-β1

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.12.007

罗宏伟，女，硕士，主治医师，研究方向：肝病的发病机制，E-mail：514329822@qq.com；张四喜，通信作者，男，硕士，副教授，研究方向：肝病检验技术，E-mail：wsk01342@163.com。

R575.1；R657.3+1

A