肝癌超声血流特点与微血管密度及血管内皮细胞生长因子的相关性研究

李新彦



肝癌超声血流特点与微血管密度及血管内皮细胞生长因子的相关性研究

李新彦①

［摘要］目的：观察彩色多普勒超声检测的肝癌血流特点，探究其与微血管密度（MVD）及血管内皮细胞生长因子（VEGF）的相关性。方法：选取60例经病理证实的原发性肝癌患者，所有患者手术切除前均行彩色多普勒超声检查，记录彩色多普勒血流显像（CDFI）显示的肿瘤血流信号，并以此为根据进行血流分级，同时检测血流阻力指数（RI）及相对灌注率；术后取肿瘤组织病理切片，采用免疫组织化学技术对肿瘤组织MVD及VEGF的表达进行检测。观察术前肝癌超声血流特点与肿瘤组织MVD及VEGF表达的关系。结果：随着肝癌血流分级的增高，肿瘤组织VEGF表达阳性率及MVD也明显增高，以Ⅲ级患者的VEGF阳性率及MVD计数最高，分别为85.0%及（51.8±20.5）个；不同血流分级患者的VEGF表达及MVD比较差异显著（x2=11.673，P＜0.05）及（F=17.892，P＜0.05），Spearman分析显示，血流分级与肝癌组织VEGF表达及MVD显著相关（x2=11.673，P＜0.05）；相对灌注率与VEGF表达、MVD显著相关（r=0.38、0.42，P＜0.05），RI与MVD的相关性明显（r=0.47，P＜0.05），而与VEGF表达无关（r=0.13，P＞0.05）。结论：彩色多普勒超声是检测原发性肝癌血流动力学特点的一种无创检查，联合VEGF及MVD这两种免疫组织化学指标，可对肝癌的血管生成状态进行有效的评价，为肝癌的诊断、治疗及预后提供重要的客观依据。

［关键词］原发性肝癌；彩色多普勒超声；微血管密度；血管内皮生长因子；免疫组化

李新彦，女，（1978- ），本科学历，主治医师。东营市东营区人民医院超声科，研究方向：超声诊断。

［First-author’s address］ Ultrasonic Department in People’s Hospital of Dongying District， Dongying， Shandong 257000， China.

原发性肝癌是临床上一种常见的恶性肿瘤，具有生长迅速、肝内或肝外转移早及病死率高等特性，给患者的生命造成了极大的威胁。同时原发性肝癌也是一种富血供肿瘤，肿瘤滋养血管的生成可对肿瘤的侵袭、生长及转移能力造成较大的影响，在肝癌的发生发展十分关键，故了解肝癌的血流特点有利于肝癌的诊断、治疗和预后判断［1］。肿瘤快速生长和繁殖转移的基础是新生血管，目前已有多种促血管生成因子被发现，其中血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的促血管生成作用较强，能明显促进内皮细胞的增殖、分裂及转移，最终导致大量新生血管的形成［2-3］。肿瘤感兴趣区（region of interest，ROI）的肿瘤微血管密度（micro vessel density，MVD）可作为检测血管形成活性的重要指标［4］。MVD是肿瘤微血管的一种定量指标，不仅能够代表肿瘤新生血管形成的程度，还对肿瘤预后的判断十分可靠。本研究对原发性肝癌患者的血流进行彩色多普勒血流显像（color Doppler flow imaging，CDFI）检测，旨在观察其血流动力学特点，了解肿瘤的供血情况，同时探究血流特点与MVD及VEGF的相关性，以对肝癌血管生成的活性进行评价，为临床治疗及预后判定提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年6月至2015年6月东营市东营区人民医院收治的60例经手术及病理证实为原发性肝癌的患者，其中男性35例，女性25例；年龄28～72岁，平均年龄（54.4±7.5）岁；病灶大小1.8～5.0 cm，平均病灶大小（3.6±1.0）cm。肿瘤中低分化癌34例，高分化癌26例。肝细胞癌53例，胆管细胞癌4例及混合型3例。发生转移的患者14例，未发生转移的患者46例。1.2 纳入与排除标准

（1）纳入标准：①所有患者术前均未行介入治疗或化疗；②术前一周内行彩色多普勒检查；③所有患者及家属均事先知情并同意接受研究。

（2）排除标准：①弥漫型肝癌患者；②多普勒超声检查未探及血流信号的患者。

1.3 仪器与材料

（1）LOGIQ-S8彩色多普勒超声诊断仪（美国GE公司生产），探头选择3.5 C和7.0 C凸阵探头，频率为2.0～10.0 MHz。

（2）VEGF鼠抗人单克隆抗体、链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化超敏试剂盒（SP）均由福建迈新生物分司提供；DAB显色试剂盒、CD34鼠抗人单克隆抗体购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.4 检测方法

1.4.1 超声检查及血流分级

（1）所有患者术前12 h禁食后取仰卧位及左侧卧位，再进行二维超声检查，在超声多切面扫描下观察整个肝脏及周围脏器的回声情况，记录肝内病灶的大小、形态、位置、包膜以及回声特点。利用彩色多普勒能量（colora Doppler energy，CDE）图对病灶周边及其内部的血流情况进行观察，应用CDFI对肝癌肿块内及周边血供情况进行显示，对彩色多普勒血流各技术参数进行调整，直至肿瘤血流显示最佳状态为止。

（2）血流分级标准［5］。①CDFI下显示肿瘤内无明显血流，且血流信号呈点状或短线状（1～2个）为Ⅰ级；②显示肿瘤内血流较为丰富，且血流信号呈点状（3～4个）或1条较长条状信号为Ⅱ级；③若显示肿瘤内血流十分丰富，且血流信号呈点状（5个以上）或2条较长条状血流信号为Ⅲ级。

（3）查找肿瘤内搏动性血流，并测量血流阻力指数（resistive index，RI），记录测得的最高收缩期峰值流速所对应的RI值。通过CDFI选出较大范围的病灶内血流分布切面图，采用Trace功能手动描绘，并测量血流信号总覆盖面积，测得的数值即为灌注面积；在二维声像图下测量病灶面积，计算相对灌注率（公式1）：

相对灌注率=灌注面积÷病灶面积×100% （1）

1.4.2 免疫组化检测VEGF表达及MVD

（1）标本准备。肝癌组织标本经手术取出后，由病理专家进行病理分型及分化程度分级。将手术标本置于10%的甲醛中固定，24 h后取材、脱水及石蜡包埋，并进行4 μm连续切片4张，其中2张分别作HE染色和免疫组化，其他2张切片备用。

（2）染色方法。采用SP法进行染色，严格按照试剂盒说明书上的操作进行，将PBS代替-抗作为阴性对照。HE染色可用于肿瘤浸润深度的检测。

（3）判断指标。①VEGF的表达［6］：细胞胞浆是VEGF的主要表达部位，胞浆内呈棕黄色颗粒分布，且分布的异质性明显为阳性细胞，计算阳性细胞表达的百分数，若百分数＞30%，记为VEGF阳性表达（+）；若百分数＜30%，记为VEGF阴性表达（-）；②MVD计数：微血管记数参照Weider血管计数法，在400倍镜下计数每个视野内被染成棕色的血管环数目，取平均值作为该例标本的MVD值［7］。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件对所有数据进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，计数资料以构成比或百分比表示。用t检验进行两组间计量资料差异比较，用多重方差分析进行多组间计量资料差异比较，用卡方分割检验进行多组间计数资料差异比较，肝癌血流特点与VEGF表达及MVD的相关性采用Spearman等级相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌血流分级与VEGF表达的关系

血流分级为Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级的肝癌患者肿瘤组织中VEGF表达阳性率分别为51.7%、66.7%和85.0%，以Ⅲ级患者VEGF阳性率明显高于其他两级，差异有统计学意义（x2=11.673，P＜0.05）；Ⅱ级患者VEGF阳性率较I级患者高，差异具有统计学意义（x2=13.468，P＜0.05）。提示肝癌患者的VGEF表达随着血流分级的增高而增高，见表1。

表1 肝癌血流分级与VEGF表达的关系[例(%)]

2.2 肝癌血流分级与MVD的关系

血流分级为Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级的肝癌患者肿瘤组织中MVD计数明显高于其他两级，Ⅱ级患者MVD计数较I级患者高，MVD计数随着血流分级的增高而增高，其差异有统计学意义（F=17.892，P＜0.05），见表2。

表2 肝癌血流分级与MVD的关系(±s)

表2 肝癌血流分级与MVD的关系(±s)

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2.3 肝癌VEGF表达及MVD与多普勒血流参数的关系

VEGF表达阳性肝癌患者的相对灌注率明显高于表达阴性的患者，两者相比差异具有统计学意义（t=6.04，P＜0.05）；而VEGF表达阳性的患者与阴性患者的RI相比较，差异无统计学意义（t=0.25，P＞0.05）。肝癌组织MVD中位数＞40组患者的相对灌注率及RI均明显高于MVD中位数＜40组患者，两者相比差异有统计学意义（t=9.037，P＜0.05），见表3。

2.4 肝癌血流分级、多普勒血流参数与VEGF表达、MVD的相关性分析

经Spearman等级相关性分析，肝癌组织VEGF表达与血流分级、相对灌注率存在显著的正相关性（r=0.38，r=0.42，P＜0.05），而与RI无相关性（r=0.13，P＞0.05）。肝癌组织MVD与血流分级、相对灌注率及RI均存在显著的正相关性（r=0.55， r=0.58，r=0.47；P＜0.05），见表4。

表3 肝癌VEGF表达及MVD与多普勒血流参数的关系(±s)

表3 肝癌VEGF表达及MVD与多普勒血流参数的关系(±s)

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表4 肝癌血流分级、多普勒血流参数与VEGF表达、MVD的相关性分析

3 讨论

近年来的研究发现，在肝癌的发生、发展、浸润及转移的各阶段，新生血管生成起着十分重要的参与作用，血管生成除能为肿瘤细胞的增殖过程提供氧气和营养外，还能够增加肿瘤转移的机会，因此研究肿瘤组织新生血管的生成对肝癌的诊治具有十分积极的指导意义［8］。目前，在观察血管生成的影像学技术中，彩色多普勒超声是最先进、最方便的研究技术，不仅具有操作简单、方便及无辐射等优点，还能提供有关肿瘤血管的重要信息，如血管的生长程度、分布、血流性质、数量以及血流动力学参数等［9］。

肝癌是一种血流丰富的高血管实性肿瘤，利用彩色多普勒超声检查肝癌组织，可显示出肿瘤组织中供血小动脉的血流信号。因此，研究肝癌超声血流特点与血管生成的关系有助于深入了解肿瘤的发生、发展及转移过程，对肝癌临床诊断、治疗及预后判定意义重大。

新生血管在肿瘤组织中的生成过程较为复杂，在临床上迄今尚未找到一种直接的检测该过程的方法。但多数肿瘤研究证实，应用免疫组化方法检测到的肿瘤组织VEGF表达及MVD计数可有效反应血管形成的活性［10］。恶性肿瘤细胞能产生较多的血管生长因子，如VEGF、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等，其中VGEF调节血管内皮细胞的作用强、特异性高，不仅能直接或间接的作用于血管内皮细胞，促进其增殖和迁移，诱导微血管形成，还能使血管的通透性增加，故VEGF可作为反映血管形成活性的指标［11］。

有研究资料显示，在许多肿瘤组织中VEGF的表达水平均较高，提示肿瘤生长与VEGF表达密切相关［11］。在临床上，微血管密度（MVD）是反映肿瘤血管生成的“金标准”，MVD计数不仅能反映出新生血管的分化程度，还对肝癌预后十分有帮助，对肝癌生物学行为及预后的判断具有重要的应用价值［12］。由于MVD存在重复性差、有创等缺点，故其临床应用一定程度上受到限制，而采用免疫组化技术测量的MVD能够对肿瘤血管进行定量，从而较好的反映血管生成活性。

本研究利用彩色多普勒技术检测肝癌患者术前癌肿块内的血流信号，对肿瘤的血供状况进行了评价及分级，并分析了血流动力学参数、血流分级与VGEF表达及MVD的关系，其结果表明，随着血流分级的增加，VGEF表达及MVD计数也明显增加，且不同血流分级患者上述指标的表达存在显著差异，表明肝癌组织多普勒超声血流分级与VGEF表达及MVD相关，可将VEGF、MVD作为反应肿瘤血管生成的有效指标。

彩色多普勒能量图是以能量方式对血管内的血流信号进行显示，由于空间分辨率及信噪比较高，且受血流方向、角度的影响较小，故此技术下的肿瘤分级及计算出的相对灌注率均较准确，相对灌注率能定量表示肝癌新生血管的血流信号，将血流丰富程度准确反映出来［13］。RI是一项评估动脉血流阻力的重要参数，其测量可反映出肝癌内血管血流动力学的状态，且角度因素不会影响RI值的测量，故该值的客观性较强。彩超可测量出RI值，故彩超能对血管生成进行直观而全面的评价。

本研究对多普勒血流参数与VEGF表达及MVD的关系进行探究，其结果表明，VEGF表达阳性组肝癌患者的相对灌注率较阴性组高，MVD高表达组（即中位数＞4）的相对灌注率较MVD低表达组（中位数＜40）高，提示相对灌注率与VEGF表达及MVD相关，且Spearman等级相关性分析进一步证实这一推测结论，即相对灌注率于VEGF表达及MVD存在显著相关性。血流等级和相对灌注率这两个参数均可在超声图像上得到宏观显示及准确判断，能反映出超声血流的丰富程度，其与VEGF表达及MVD的密切关系表明超声指标对微血管丰富程度的反映是直观的，能为宏观上评价肝癌的发生、发展及转移提供理论依据［14］。本研究显示，RI值在VEGF表达阳性组与阴性组中的检测情况比较不存在统计学意义，而MVD中位数＞40组的RI值高于MVD中位数＜40组，且Spearman分析显示RI、MVD两者之间存在显著相关性，而RI、VEGF表达两者无相关性，提示RI与MVD关系密切，而与VEGF表达无关。究其原因：①多种血管生成因子和抑制因子共同参与肝癌血管生成的调节，包括VEGF，但这种生长因子并未发挥决定性作用；②VEGF对肿瘤内血流的影响是通过提高肿瘤血管的通透能力而实现，而MVD可直接反映肿瘤血管的增生，故VEGF与新生血管的关系不如MVD密切。由于免疫组化检测是在组织取材基础上进行的，因而检测出的VEGF表达及MVD仅能反映肿瘤的局部情况，不能对整个肿瘤情况进行全面的显示，故对肝癌肿瘤组织血管生成情况，RI只起到间接的评价作用，与杨一林等［15］的报道一致。

综上所述，肝癌彩色多普勒超声血流特点与VEGF及MVD的相关性十分明显，超声指标可宏观上反映肿瘤血管的生成，VEGF和MVD的免疫组化检测可微观上反映出肿瘤血管的增生情况，超声与VEGF、MVD的结合可对肝癌血管生成进行更好的评估，对肝癌临床诊断、治疗及预后评估具有重要的应用价值。

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①东营市东营区人民医院超声科 山东 东营 257000

［文章编号］1672-8270（2016）05-0083-05 ［中图分类号］ R445.1

［文献标识码］A

DOI:10.3969/J.ISSN.1672-8270.2016.05.026

作者简介

收稿日期：2015-09-24

Correlation of liver cancer ultrasound blood flow characteristics and MVD and VEGF

LI Xin-yan

China Medical Equipment，2016，13（5）:83-87.

［Abstract］ Objective: To investigate the characteristics of color Doppler ultrasound of liver cancer blood test， and explore the microvessel density（MVD） and vascular endothelial growth factor（VEGF） relevance. Methods: 60 cases of primary liver cancer patients confirmed pathologically were selected. All the patients were underwent color Doppler ultrasound examination before the surgical resection. The signal of tumor blood flow was recorded from color Doppler flow imaging（CDFI）， and the blood flow was graded. Simultaneously， vascular resistance index（RI） and relative perfusion rate were detected. The tumor tissue biopsy was taken from the postoperative patients and tumor tissue MVD and VEGF were detected by immunohistochemical techniques， in order to observe the relationship between blood flow characteristics and tumor tissue MVD and VEGF expression in liver cancer before intraoperative ultrasound. Results: With the increasing flow grade of liver cancer， the tumor tissue and positive expression rate of VEGF were significantly higher than MVD expression. The difference of VEGF expression and MVD between the different flow grade were significantly（x2=11.673， P＜0.05； F=17.892， P＜0.05）. The positive rate of VEGF（85.0%） and MVD count（51 8±20.5.）in III stage patients were the highest. Spearman analysis showed that flow grade with tumor tissue VEGF and MVD was significantly correlated（x2=11.673， P＜0.05）. Relative perfusion rate and VEGF expression and MVD were significantly correlated（r=0.38， 0.42， P＜0.05）， RI and MVD was significantly associated（r=0.47， P＜0.05）， but there was nothing to do with VEGF expression（r=0.13， P＞0.05）. Conclusion: Color Doppler ultrasonography which is a non-invasive examination is to detect the hemodynamic characteristics of hepatocellular carcinoma， combined with VEGF and MVD. It can give effective evaluation to the state of liver cancer angiogenesis and provide evidence to the diagnosis， treatment and prognosis of liver cancer.

［Key words］Primary liver cancer； Color Doppler ultrasound； Microvessel density； Vascular endothelial growth factor； Inmunohistochemistry