过敏性和冠心病猝死者心肌组织中肥大细胞类胰蛋白酶、脑利钠肽的表达

史洁茹，田成俊，曾　强，郭相杰，路　健，高彩荣（.山西医科大学法医学院法医病理教研室，山西 太原 03000；.盂县公安局，山西 阳泉 04500）



·论著·

过敏性和冠心病猝死者心肌组织中肥大细胞类胰蛋白酶、脑利钠肽的表达

史洁茹1，田成俊2，曾强1，郭相杰1，路健1，高彩荣1
（1.山西医科大学法医学院法医病理教研室，山西 太原 030001；2.盂县公安局，山西 阳泉 045100）

摘要：目的 探讨肥大细胞类胰蛋白酶、脑利钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）在过敏性猝死和冠心病猝死鉴别诊断中的意义。方法 选取山西医科大学法医病理学教研室2010—2015年尸检案例心肌标本共30例，分为颅脑损伤致死组、过敏性猝死组、冠心病猝死组，每组各10例。采用免疫荧光染色和Western印迹法分析各组心肌组织肥大细胞类胰蛋白酶和BNP的表达。结果 过敏性猝死组、冠心病猝死组心肌组织内肥大细胞类胰蛋白酶免疫荧光染色均出现阳性染色；三组间两两比较，表达差异均具有统计学意义（P＜0.05）。冠心病猝死组心肌组织内BNP的表达量高于过敏性猝死组、颅脑损伤致死组（P＜0.05），过敏性猝死组与颅脑损伤致死组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 联合检测心肌组织内肥大细胞类胰蛋白酶、BNP有望为过敏性猝死和冠心病猝死的法医学鉴别诊断提供帮助。

关键词：法医病理学；猝死；过敏反应；冠状动脉硬化；肥大细胞；类胰蛋白酶类；利钠肽，脑

鉴别诊断过敏性猝死与冠心病猝死是法医学实践中常见任务之一，特别是在使用药物或输液过程中发生的猝死案例，冠心病常常会作为基础病变参与过敏性休克的死亡过程，然而由于过敏性猝死病程短暂，缺乏特异性的病理改变，给两者的鉴别诊断带来一定困难。有研究［1-2］发现，过敏性疾病患者体内肥大细胞类胰蛋白酶含量较正常人群高，有助于诊断过敏性疾病。但也有研究［3］发现，冠心病时体内肥大细胞类胰蛋白酶含量也升高。因此单独应用肥大细胞类胰蛋白酶来鉴别两者尚缺乏说服力，还需要其他指标联合诊

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1样本

选取山西医科大学法医病理学教研室2010—2015年尸体检验案例心肌标本共30例，均于死后48～96h内解剖，心肌标本-80℃保存。实验分为三组：颅脑损伤致死组10例，因交通事故致严重颅脑损伤而死亡，无冠状动脉及其他心源性疾病，排除过敏性疾病；过敏性猝死组10例，经尸体解剖、组织学观察及实验室检验严格排除中毒、暴力以及其他心源性疾病等，并结合过敏原接触史、临床表现、肥大细胞类胰蛋白酶测定等确诊为过敏性猝死者；冠心病猝死组10例，经尸体解剖及组织学观察为冠状动脉粥样硬化，管腔狭窄程度≥Ⅲ级，但未发现明显心肌梗死，严格排除过敏及其他心源性疾病，确诊死因为冠心病猝死者。

1.1.2试剂和仪器

免疫荧光染色：小鼠抗人类胰蛋白酶抗体（AA1）、罗丹明标记山羊抗小鼠IgG-TRITC（sc-3796）均购自美国Santa Cruz生物技术公司。

Western印迹法：兔抗人β-actin抗体（I102）购自美国Bioword Technology公司；小鼠抗人类胰蛋白酶抗体（ab2378）、兔抗人BNP抗体（ab92500）均购自美国Abcam公司，HRP标记山羊抗鼠IgG（BA1050）、HRP标记山羊抗兔IgG（BA1054）均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1肥大细胞类胰蛋白酶的免疫荧光染色检测

颅脑损伤致死组和过敏性猝死组选取左心室心肌组织，冠心病猝死组选取冠脉狭窄程度最重的相应供血区心肌组织，甲醛固定、脱水、透明、石蜡包埋、4μm切片，脱蜡至水，微波法抗原修复，BSA封闭，实验组由兔抗人肥大细胞类胰蛋白酶一抗（1∶400）、罗丹明标记羊抗兔二抗（1∶200）孵育，阴性对照组经PBS以及罗丹明标记羊抗兔二抗（1∶200）孵育，空白对照组仅由PBS孵育；封片。BX61荧光显微镜（日本Olympus公司）进行观察，取荧光强度最强的层面，每张切片200倍视野下随机选取5个视野进行拍照，应用Image-pro plus 6.2软件计数阳性颗粒数。

1.2.2肥大细胞类胰蛋白酶、BNP的Western印迹法检测

颅脑损伤致死组和过敏性猝死组选取左心室心肌组织，冠心病猝死组选取冠脉狭窄程度最重的相应供血区心肌组织各100mg，加入哺乳动物组织抽提试剂、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF），液氮环境下充分研磨，4℃孵育3 h，4℃下以离心半径10cm，12000r/min，离心10min。取上清液，BCA法蛋白定量；SDS-PAGE电泳，湿式转印160mA、70 min转印至PVDF膜；β-actin抗体（1∶5 000），类胰蛋白酶抗体（1∶1 000），BNP抗体（1∶4 000），4℃过夜；HRP标记山羊抗鼠二抗（1∶2 000），HRP标记山羊抗兔二抗（1∶2000）室温1h，ECL发光，Vision Works L S分析软件（美国UVP公司）扫描Western印迹法结果，以目的蛋白灰度值与β-actin灰度值的比值表示肥大细胞类胰蛋白酶、BNP的相对表达量。各组均以β-actin作为内参照。

1.3统计学分析

实验所得数据用SPSS 17.0软件进行方差分析，组间两两比较采用最小显著性差异法（least-significant difference，LSD）t检验，数据用±s 表示。检验水准α=0.05。

2　结果

2.1肥大细胞类胰蛋白酶的免疫荧光染色及检测结果

在荧光的激发下，罗丹明产生643nm发射波长，肥大细胞类胰蛋白酶阳性染色为橙红色，过敏性猝死组（图1A）、冠心病猝死组（图1B）心肌组织内均出现较多肥大细胞类胰蛋白酶阳性染色；颅脑损伤致死组心肌偶见少量阳性染色（图1C）；空白、阴性对照组心肌未见明显阳性染色（图1D）。心肌组织内阳性肥大细胞类胰蛋白酶颗粒以心肌间质中小血管周围多见。三组间阳性颗粒两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05，表1）。

2.2肥大细胞类胰蛋白酶的Western印迹法结果

各组类胰蛋白酶在心肌组织内均有阳性表达，位于31000处。过敏性猝死组肥大细胞类胰蛋白酶表达最强，冠心病猝死组呈弱阳性表达，颅脑损伤致死组表达较弱（图2）。三组肥大细胞类胰蛋白酶两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05，表2）。

2.3BNP的Western印迹法结果

各组BNP均有阳性表达，位于15000处。冠心病猝死组BNP表达最强，过敏性猝死组呈弱阳性表达，颅脑损伤致死组表达较弱（图3）。冠心病猝死组BNP的表达量高于过敏性猝死组和颅脑损伤致死组（P＜ 0.05），过敏性猝死组与颅脑损伤致死组之间差异无统计学意义（P＞0.05，表2）。

表1　各组心肌组织内肥大细胞类胰蛋白酶的表达　（n=10，±s）

表1　各组心肌组织内肥大细胞类胰蛋白酶的表达　（n=10，±s）

注：1）与颅脑损伤致死组相比，P＜0.05；2）与过敏性猝死组相比，P＜0.05

组别　阳性颗粒数颅脑损伤致死　1.18±0.20过敏性猝死　32.24±0.951）冠心病猝死　20.86±0.601）2）

表2　各组心肌组织内类胰蛋白酶和BNP与β-actin灰度值的比值　（n=10，±s）

表2　各组心肌组织内类胰蛋白酶和BNP与β-actin灰度值的比值　（n=10，±s）

注：1）与颅脑损伤致死组相比，P＜0.05；2）与过敏性猝死组相比，P＜0.05

组别　类胰蛋白酶/β-actin　BNP/β-actin颅脑损伤致死　0.28±0.15　0.42±0.26过敏性猝死　0.88±0.121）　0.59±0.20冠心病猝死　0.53±0.071）2）　1.06±0.061）2）

3　讨论

肥大细胞在心内膜下、心外膜下、心肌细胞间及近血管周围都有存在。肥大细胞类胰蛋白酶由肥大细胞表达，以活性形式储存于肥大细胞颗粒中，当肥大细胞活化后，胞质内的颗粒与胞膜融合，脱颗粒释放类胰蛋白酶至组织间质。研究［6-7］表明，过敏性休克患者体内肥大细胞类胰蛋白酶的含量较正常人群高，并且在冷藏48h、冷冻7d的情况下，机体仍能维持其含量的稳定。近期研究［8-11］发现，冠心病患者体内肥大细胞类胰蛋白酶含量也升高，肥大细胞类胰蛋白酶通过分泌一系列蛋白酶、生长因子、细胞因子等促进泡沫细胞生成、聚集，使局部胶原沉积，从而引起动脉粥样硬化。本实验中肥大细胞类胰蛋白酶的免疫荧光染色结果显示，过敏性猝死组和冠心病猝死组心肌组织中均出现阳性颗粒。Western印迹法检测结果显示，颅脑损伤致死组、冠心病猝死组、过敏性猝死组心肌组织中肥大细胞类胰蛋白酶表达量依次递增，且组间两两比较差异均有统计学意义，进一步证明了肥大细胞类胰蛋白酶表达量的增加并不一定意味着过敏反应，过敏和冠心病猝死都会引起其增加，只是过敏性猝死后肥大细胞的激活程度更加显著，而冠心病猝死后的激活程度是有限的。说明肥大细胞类胰蛋白酶可以为鉴别过敏性猝死和冠心病猝死提供一定的依据，但任何一个指标单独应用都是有局限的，所以鉴别两者尚需联合其他指标。

BNP是反映心源性猝死风险大小的独立指标［12］。Hama等［13］发现，急性心肌梗死后，大鼠的左心室梗死区存活细胞、左心室非梗死区心肌细胞、右心室正常心肌细胞以及血浆的BNP表达量都会增加，且梗死区与非梗死区BNP的高表达程度基本一致。说明BNP是心肌负荷增大时的产物，在心肌梗死发生后，梗死区心肌变薄，使得不同区域间的张力增加，进一步刺激了周围的心肌细胞释放BNP。另外，他还发现血浆BNP升高并不是由坏死心肌通透性增加引起的，而是与再合成有关。这说明心肌梗死后，BNP主要是由完整的心室肌细胞合成释放的，所以BNP要比其他坏死心肌细胞的标志物释放早，对心肌缺血也更敏感。本实验中冠心病猝死组心肌组织内BNP的表达量明显高于过敏性猝死组和颅脑损伤致死组，说明BNP可以作为诊断冠心病猝死的辅助指标。此外，有报道［14］认为过敏反应也可导致心肌缺血、冠状动脉痉挛等心脏事件的发生，但目前并不清楚究竟过敏反应对心肌组织内的BNP有无影响。本实验中过敏性猝死组与颅脑损伤致死组之间差异无统计学意义，说明过敏反应对心肌组织内的BNP影响不大。

本实验结果表明，过敏性猝死后肥大细胞类胰蛋白酶明显增加，而冠心病猝死后增加不明显；过敏性猝死后BNP增加不明显，而冠心病猝死后明显增加。提示BNP能够弥补肥大细胞类胰蛋白酶的不足，其检测结果升高可以反映出是否存在冠心病猝死。当可疑过敏与冠心病并存时，经系统的尸体解剖及病理观察后，若检测到肥大细胞类胰蛋白酶表达量增加，而BNP无明显变化则死因倾向于过敏性猝死；若检测到肥大细胞类胰蛋白酶表达量无明显变化，而BNP明显增加则死因倾向于冠心病猝死。因此，当怀疑为过敏性猝死又难以排除冠心病猝死时，联合检测死后心肌组织内肥大细胞类胰蛋白酶和BNP，有望为鉴别诊断过敏性猝死与冠心病猝死提供一个新的思路。

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（本文编辑：黄平）

中图分类号：DF795.1

文献标志码：A

doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2016.03.001

文章编号：1004-5619（2016）03-0161-04

基金项目：国家自然科学基金面上资助项目（81172905）；山西省科技攻关资助项目（20140313015-7）

作者简介：史洁茹（1989─），女，硕士研究生，主要从事猝死病理学研究；E-mail：15535375426@163.com

通信作者：高彩荣，女，博士，教授，博士研究生导师，主要从事猝死病理学教学、研究和检案；E-mail：gaocairong5175@163.com断。研究［4-5］发现，脑利钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）的表达量与心肌梗死面积、冠状动脉病变的严重程度正相关，可以反映死前的心功能状态。因此，本实验应用免疫荧光染色和Western印迹技术分析心肌组织内肥大细胞类胰蛋白酶和BNP的表达情况，旨在探讨两者在过敏性猝死和冠心病猝死鉴别诊断中的应用价值。

收稿日期：（2014-03-09）

Expressions of Mast Cell Tryptase and Brain Natriuretic Peptide in Myocardium of Sudden Death due to Hypersensitivity and Coronary Atherosclerotic Heart Disease

SHI Jie-ru1，TIAN Cheng-jun2，ZENG Qiang1，GUO Xiang-jie1，LU Jian1，GAO Cai-rong1
（1.Department of Forensic Pathology，School of Forensic Medicine，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China；2.Public Security Bureau of Yu Country，Yangquan 045100，China）

Abstract：Objective To explore the value of mast cell tryptase and brain natriuretic peptide（BNP）in the differential diagnostic of sudden death due to hypersensitivity and coronary atherosclerotic heart disease.Methods Totally 30 myocardial samples were collected from the autopsy cases in the Department of Forensic Pathology，Shanxi Medical University during 2010—2015.All samples were divided into three groups：death of craniocerebral injury group，sudden death of hypersensitivity group and sudden death of coronary atherosclerotic heart disease group，10 cases in each group.Mast cell tryptase and BNP in myocardium were detected by immunofluorescence staining and Western Blotting.Results Immunofluorescence staining showed that the positive staining mast cell tryptase appeared in myocardium of sudden death of hypersensitivity group and coronary atherosclerotic heart disease group.Among the three groups，the expression of mast cell tryptase showed significantly differences through pairwise comparison（P＜0.05）；The expression level of BNP in sudden death of coronary atherosclerotic heart disease group were significantly higher than the sudden death of hypersensitivity group and death of craniocerebral injury group（P＜0.05）. The difference of the expression level of BNP between the sudden death of hypersensitivity group and the death of craniocerebral injury group had no statistical significance（P＞0.05）.Conclusion The combined detection of the mast cell tryptase and BNP in myocardium is expected to provide help for the forensic differential diagnosis of sudden death due to hypersensitivity and coronary atherosclerotic heart disease.

Key words：forensic pathology；death，sudden；anaphylaxis；coronary arteriosclerosis；mast cells；tryptases；natriuretic peptide，brain