不同温度下大鼠脑组织RNA降解与早期PMI的相关性

吕叶辉，李志宏，托　娅，刘　丽，李　堃，卞　杰，马剑龙，陈　龙（．上海健康医学院基础医学院，上海 038；．复旦大学基础医学院法医学系，上海 0003）



不同温度下大鼠脑组织RNA降解与早期PMI的相关性

吕叶辉1，李志宏1，托娅1，刘丽1，李堃1，卞杰1，马剑龙2，陈龙2
（1．上海健康医学院基础医学院，上海 201318；2．复旦大学基础医学院法医学系，上海 200032）

摘要：目的 探讨大鼠脑组织8种RNA指标，在不同温度下的表达水平与早期死亡时间（PMI）的相关性。方法 将222只SD大鼠随机分为对照组（死后0h）和4个实验组，实验组断颈处死后分别置于5℃、15℃、25℃和35℃的环境中，于死后1～24 h内9个时间点提取脑组织RNA，利用实时荧光定量PCR技术检测8种RNA指标（β-actin、GAPDH、RPS29、18S rRNA、5S rRNA、U6 snRNA、miRNA-9及miRNA-125b）的表达水平，geNorm软件选取合适内参，SPSS软件对内参标准化RNA指标进行回归分析，R软件构建推断PMI的数学模型，另选6只已知PMI的SD大鼠予以验证。结果 5S rRNA、miR-9和miR-125b表达稳定，可作为内参指标。β-actin和GAPDH具有良好的时序性降解规律，在24h内随PMI延长不断降解。R软件拟合得ΔCt值随PMI和温度变化的数学模型可用以推断PMI。运用β-actin和GAPDH验证模型的平均误差率分别为14.1%和22.2%。结论 β-actin和GAPDH表达水平与PMI和环境温度相关性良好。本研究建立的数学模型可为温度变化条件下的早期PMI推断提供参考。

关键词：法医病理学；RNA；死亡时间；温度；降解；大鼠

死亡时间（PMI）是指发现、检查尸体时距死亡发生时的时间间隔，PMI的精确推断有助于迅速确定涉案罪犯以及排除嫌疑人，为侦查部门提供重要线索，并为司法实践提供重要科学依据。利用传统的方法进行PMI推断，其结果易受主观因素和外界环境因素的影响，导致推断的精确性较低。

随着分子生物学技术在法医学领域的广泛应用，利用RNA的时间依赖性降解规律推断PMI正逐渐成为研究热点［1］，但针对RNA在不同温度下早期PMI降解规律的研究较少。本研究利用实时荧光定量

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

仪器：9700型PCR扩增仪、Prism 7500型荧光定量PCR仪（美国AB公司），NanoDrop 1000分光光度计（美国Thermo公司），Agilent 2100生物分析仪（美国Agilient公司）。

试剂：TRIzol试剂盒（美国 Invitrogen公司），RNAlater保护液、PrimeScriptTMRT试剂盒、One Step PrimeScriptTMmiRNA cDNA Synthesis试剂盒、SYBR® Premix Ex TaqTM试剂盒（日本TaKaRa公司），DEPC水（焦碳酸二乙酯处理并经高温高压灭菌的MiliQ纯水）。

1.2实验动物分组及处理

清洁级成年雄性SD大鼠228只，体质量（220± 20）g，由复旦大学上海医学院实验动物部提供，随机选取其中6只备用，其余222只大鼠断颈处死后随机分为对照组（死后即刻0h，6只）和4个实验组（每组54只）。实验组大鼠尸体分别置于（5±1）℃、（15±1）℃、（25±1）℃和（35±1）℃环境中，并分别在死后1、3、6、9、12、15、18、21、24 h（每个时间点6只）提取大鼠额叶脑组织50～100mg。另取6只备用的大鼠，断颈处死后随机分为3组，尸体分别置于（10±1）℃、（20±1）℃和（30±1）℃环境中，并分别在死后10、20h（每个时间点1只）提取大鼠额叶脑组织50～100 mg，用以验证数学模型。所取脑组织均用无菌眼科剪剪碎后分装于RNAlater保护液中，置于-80℃冻存。

1.3总RNA提取

准确称取脑组织质量，加入液氮研碎组织后转入匀浆器中，按照TRIzol试剂盒总RNA提取说明书操作步骤提取总RNA，加入30μL DEPC水溶解后置于-80℃冻存。NanoDrop 1000分光光度计测定RNA的纯度及浓度，用光密度（D）表示，并检测D260/D280值。Agilent 2100生物分析仪测定RNA完整性，用RNA完整性指数（RNA integrity number，RIN）表示。

1.4指标选择

本研究选择8种RNA指标，分别为β-肌动蛋白（β-actin）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、核糖体蛋白S29 （ribosomal protein S29，RPS29）、18S核糖体RNA（18S ribosomal RNA，18S rRNA）、5S核糖体RNA（5S ribosomal RNA，5S rRNA）、U6微核RNA（U6 small nuclear RNA，U6 snRNA）、微小RNA-9（miRNA-9，miR-9）及微小RNA-125b（miRNA-125b，miR-125b）。引物设计至少跨一个外显子或外显子区域以保证cDNA正确的合成与扩增，扩增产物片段长度均在200bp以下。引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列见表1。

表1　实验选取的RNA指标及引物序列

1.5总RNA反转录

应用PrimeScriptTMRT试剂盒对总RNA进行反转录，以用于β-actin、GAPDH、RPS29、18S rRNA的实时荧光定量PCR。取RNA样本500 ng进行反转录，按照试剂盒说明书配置10μL反应体系。反应条件：37℃ 15 min，85℃ 5 s，1个循环。应用One Step PrimeScriptTMmiRNA cDNA Synthesis试剂盒对总RNA进行反转录，以用于5S rRNA、U6 snRNA、miR-9、miR-125b的实时荧光定量PCR。取RNA样本500ng进行反转录，按照试剂盒说明书配置10μL反应体系，反应条件：37℃ 60 min，85℃ 5 s，1个循环。将反转录产物cDNA以1∶10稀释，置于-20℃冻存。

1.6实时荧光定量PCR

应用SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒进行实时荧光定量PCR反应。按照试剂盒说明书配制20 μL反应体系，并应用Prism 7500型荧光定量PCR仪进行扩增。扩增条件：95℃ 30s，1个循环；95℃ 5s，60℃34 s，40个循环；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，1个循环。每个样本重复三次，结果由系统自动生成，从而得到各个RNA指标的循环阈值（cycle threshold，Ct值）。

1.7统计学分析

1.7.1RNA浓度及完整性检测

运用SPSS v22.0（美国SPSS公司）对RNA单位质量浓度及RIN进行统计分析，多组间运用单因素方差分析，两组间运用t检验进行差异性分析。检验水准α=0.05。

1.7.2内参选择

运用geNorm v3.5软件（比利时Biogazelle公司）［2］对RNA指标的Ct值进行统计学处理。根据平均表达稳定度M值确定最稳定的指标，M值越小，指标的稳定性越高。根据平均表达稳定度的配对变异V值判断引入新的内参指标是否会对标准化因子产生显著影响，默认V值为0.15，如果Vn/Vn+1（n＞1）小于0.15（当多个V值符合时选取最小值），说明n或n+1个RNA指标可以作为内参指标使用。除内参指标外，其余RNA指标作为候选指标。

1.7.3模型建立

运用SPSS v22.0、Excel 2010（美国Microsoft公司）软件对候选RNA指标 Ct值进行内参标准化（ΔCt=Ct候选指标-Ct内参均值），内参均值为内参指标的几何平均数，并对不同温度组下候选RNA指标ΔCt值及PMI进行三次方回归分析并计算相关系数r，平均相关系数较高的候选指标将被用于构建模型。运用R v3.2.3软件（美国RStudio公司）构建以温度（x）、PMI（y）为自变量，ΔCt值（z）为因变量的三元二次方程，即z=k1x2+k2x+k3xy+k4y+k5y2+k0。使用MATLAB v7.0软件（美国MathWorks公司）将方程转为三维可视化数学模型。检验水准α=0.01。

1.7.4模型验证

将已知PMI的备用大鼠样本数据代入模型进行验证，并计算推断PMI和实际PMI之间的差异程度，用推断误差及误差率表示，推断误差=|PMI推断-PMI实际|，误差率=|PMI推断-PMI实际|/PMI实际×100%。

2　结果

2.1RNA纯度、浓度、完整性及实时荧光定量PCR结果

测得所有RNA样本的D260/D280均在1.8～2.0，证明RNA纯度较高。各组间RNA单位质量浓度差异无统计学意义（P＞0.05）。对照组RIN值为9.45±0.08 （9.2～9.7），5℃组为9.20±0.11（8.6～9.6），15℃组为8.40±0.25（7.2～9.6），25℃组为7.42±0.55（4.8～9.2），35℃组为7.06±0.73（3.5～9.4）。与对照组相比，5℃组RIN值差异无统计学意义（P＞0.05），而15℃、25℃和35℃组RIN值降低（P＜0.05），表明在较高温度下RNA逐渐降解，其完整性随PMI延长逐渐降低。

所有样品均成功反转，得到Ct值。扩增曲线和溶解曲线完好，表明样本均成功特异性扩增。

2.2内参选择结果

4个不同温度组的RNA指标的平均表达稳定度M值及标准化因子的配对变异Vn/Vn+1值，如表2所示。以5℃组为例，RNA指标平均表达稳定度M值由高到低排序依次为β-actin＞GAPDH＞18S rRNA＞RPS29＞U6 snRNA＞miR-9＞5S rRNA=miR-125b，表明5S rRNA和miR-125b稳定性最好，而β-actin和GAPDH较不稳定；相比其他Vn/Vn+1值，V3/V4小于0.15且最小，表明选择3个或4个RNA指标作为5℃组内参最为合适，即miR-9、5S rRNA、miR-125b或U6 snRNA、miR-9、5S rRNA、miR-125b。

表2　不同温度组RNA指标的稳定性对比

以此类推，15℃组内参为miR-9、5S rRNA、miR-125b或 U6 snRNA、miR-9、5S rRNA、miR-125b；25℃组内参为miR-9、miR-125b或5S rRNA、miR-9、miR-125b；35℃组内参为miR-9、miR-125b或5S rRNA、miR-9、miR-125b。

综合4个温度组对RNA指标进行分析，5S rRNA、miR-9和miR-125b在各温度组均有较好的稳定性；U6 snRNA在5℃、15℃组相对稳定，但在25℃、35℃组稳定性下降；β-actin和GAPDH在4个温度组中均不稳定。因此，4个温度组均选择5S rRNA、miR-9和miR-125b作为内参指标，其余RNA指标作为候选指标。

2.3PMI推断的模型建立

对候选RNA指标的Ct值进行内参标准化，即Ct内参均值=（Ct5S rRNA×CtmiR-9×CtmiR-125b）1/3。利用统计软件对4个温度组内5种候选RNA指标的ΔCt值和PMI进行三次方回归分析并计算相关系数r，如表3所示。

表3　不同温度组内参标准化的RNA指标与PMI的相关性分析（r值）

结果表明，18S rRNA、RPS29和U6 snRNA在5℃、15℃时与PMI相关性较低，但在25℃、35℃时与PMI相关性提高；β-actin和GAPDH在4个温度组内都与PMI有着良好的相关性，且β-actin和GAPDH的平均r值均高于0.87；因此选择β-actin和GAPDH用于构建推断PMI的数学模型。

运用R v3.2.3软件构建三元二次方程，统计结果表明x、xy、y、y2、k0项具有统计学意义（P＜0.01），重新计算后得到β-actin的方程为z=0.0048x+0.0023xy+ 0.033 1 y-0.001 5 y2+3.567 7，GAPDH的方程为z= -0.002 7 x+0.003 0 xy+0.028 3 y-0.000 5 y2+2.650 8；决定系数R2分别为0.9375和0.9017，表明拟合优度较高。

使用MATLAB v7.0软件将方程转为三维可视化数学模型，β-actin和GAPDH的模型如图1～2所示。结果显示，早期PMI内，β-actin和GAPDH的ΔCt值随着PMI延长不断增加，而且ΔCt值增加的速率不仅与PMI相关，也与环境温度相关。

2.4PMI推断的模型验证

运用R软件将6只备用大鼠样本的ΔCt值及温度分别代入β-actin、GAPDH模型进行验证，分别得到两者的PMI推断值，并计算推断PMI与实际PMI的误差率，如表4所示。运用β-actin模型进行PMI推断，平均推断误差为1.9h，平均误差率为14.1%；运用GAPDH模型进行PMI推断，平均推断误差为3.0h，平均误差率为22.2%。对于环境温度较高（30℃）、PMI较长（20 h）的样本，运用该模型进行PMI推断时，推断误差和误差率相对较低。

表4　β-actin和GAPDH数学模型验证结果

3　讨论

早期PMI（24 h内）是指尸体未出现明显腐败现象的时期，对于法医鉴定来说更常用也更重要，因此早期PMI的精确推断一直是法医学研究的重点和难点。近年来随着分子生物学的发展，利用生物体内大分子来推断PMI成为当前研究的热点，尤其是依据RNA的时间依赖性降解规律推断PMI已经取得了一些进展［3］。由于RNA的降解不仅与PMI有关，在很大程度上也受到环境温度的影响，因此相关研究也会考虑此影响因素，但多数研究仅将实验温度设定在室温或单个环境温度下［4-5］，而在实际检案中尸体处于不断变化的环境温度中，因此单一的实验温度设定会限制其实用性。本研究设定4个连续温度的实验组，即5℃、15℃、25℃和35℃，选择受其他因素影响较小的脑组织作为检材，8种RNA作为指标，利用实时荧光定量PCR检测RNA降解规律以推断PMI。

作为快速高效的RNA定量技术，实时荧光定量PCR技术在PMI推断的研究中得到广泛应用。为了保证结果的可重复性和客观性，在应用该技术时应对各项操作进行统一规范。Bustin等［6］提出的标准化实时荧光定量PCR指南（the minimum information for publication of qRT-PCR experiments，MIQE）正逐渐被广泛认可。本实验流程均按照MIQE指南进行，包括样本的采集、处理和准备，RNA的质量控制、反转录效率、引物设计、扩增曲线、溶解曲线检测灵敏性、特异性、内参指标的选择、数据处理等。其中，定量PCR结果很大程度上依赖于内参指标的标准化处理［6-8］。因此，筛选出稳定适用、较少受PMI和温度影响的内参指标就显得尤为必要。

经geNorm软件统计后，5S rRNA、miR-9和miR-125b在4个温度组中都比较稳定，因此将这3种指标作为本研究的内参指标，其余指标作为候选指标。5S rRNA在miRNA研究中常被选作内参基因［9-10］，其存在于核糖体蛋白复合物中，可适度隔绝核酶和其他因素的影响，使之保持稳定。相对于18S rRNA，5S rRNA片段较短，受PMI及温度因素的影响较小，更适合作为PMI推断的内参指标。miRNA属于非编码小RNA家族，其长度只有21～25 bp，以往研究［11-13］证实，miRNA在死后一段时间内表达稳定。在不同温度组中，miR-9 和miR-125b在死后24h内均保持稳定，表明miRNA适合作为PMI推断的内参指标。此外miR-9和miR-125b均是脑组织特异性miRNA［14］。β-actin和GAPDH是常用的RNA指标，性质相对稳定保守［15］。本课题组在前期研究中也常选用β-actin和GAPDH作为候选指标进行PMI推断［11-12，16］。U6 snRNA在PMI相关研究中也常被选作内参指标［7，11］，张萍等［17］证实死亡早期人体心肌组织中U6 snRNA表达稳定，其稳定性可能与其本身的发卡结构及存在的细胞核中没有核酶有关。本研究脑组织中U6 snRNA在温度较低时表达稳定，但在温度较高（尤其是35℃组）时稳定性降低，即U6 snRNA稳定性与温度有关，不适合作为本研究内参指标，这可能是由于通常状态下与snRNA结合成复合物的小核核糖核蛋白（small nuclear ribonucleoprotein，snRNP）在较高温度时降解所致［18］。RPS29和18S rRNA也是检测PMI的常用指标，降解规律在不同实验条件下呈现出不同的模式［5，11-12］，还需进一步研究。

对上述5种候选RNA指标进行内参标准化处理，在各温度组分别对ΔCt值和PMI进行回归分析，并依据相关系数筛选出与PMI相关性最好的RNA指标。结果表明，β-actin、GAPDH在不同条件下均具有较高的相关系数。内参选择时也印证了这一点，即β-actin和GAPDH在4个温度组中都具有较高的M值。相较其他候选RNA指标，β-actin和GAPDH更容易受到PMI的影响，在24h内随PMI延长不断降解，拥有良好的时序性降解规律，与一些前期研究［11-12，19］一致。考虑到环境温度的影响，为了使PMI推断结果更加精确，本研究使用R软件分别对β-actin和GAPDH进行多参数拟合，得到ΔCt值、温度和PMI三个变量的三元二次方程，决定系数R2分别为0.9375和0.9017，表明拟合优度较高。说明在不同温度下，β-actin和GAPDH有着相似的降解规律，ΔCt值与PMI的关系近似符合三元二次方程分布。在24 h内，β-actin和GAPDH的ΔCt值随着PMI延长不断增加，表明RNA 随PMI不断降解。温度较低时ΔCt值增加速率较慢，而温度较高时ΔCt值增加速率较快，表明ΔCt值升高速率与环境温度也呈正相关关系，证实随着环境温度的增高，RNA的降解速率加快。

为确保PMI推断的准确性，本研究还利用已知PMI的备用大鼠样本对数学模型进行验证。运用βactin模型进行验证时，实际PMI为10h的样本，推断误差在2.3 h内；实际PMI为20 h的样本，推断误差在3.6h内。运用GAPDH模型进行验证时，实际PMI 为10h的样本，推断误差在3.9h内；实际PMI为20h的样本，推断误差在5.5h内。相较GAPDH，利用βactin模型进行PMI推断更为精确，这可能是由于βactin模型拥有更高的决定系数，拟合优度较好。环境温度越高、PMI越长，利用该模型推断PMI的精确性越高，推测是由于随PMI的延长和环境温度增高，RNA降解速率加快以致ΔCt增加明显所致。

本研究利用实时荧光定量PCR技术观察大鼠脑组织8种RNA指标在5℃、15℃、25℃和35℃环境中的早期降解规律。实验结果显示，在4个温度组中，5S rRNA、miR-9和miR-125b表达稳定，适合作为内参指标。经内参标准化处理后β-actin和GAPDH与PMI和环境温度有着较好的相关性，表明RNA降解不仅与PMI有关，也与环境温度有关。经R软件拟合ΔCt值、温度和PMI三个变量，分别得到β-actin和GAPDH的数学模型推断PMI。用已知PMI的大鼠样本进行验证，结果证实运用该数学模型推断早期PMI相对准确有效，有望成为早期PMI推断的新方法。在今后的研究中，本课题组将对以上实验结果进一步使用人体资料进行验证。

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（本文编辑：邹冬华）

中图分类号：DF795.1

文献标志码：A

doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2016.03.002

文章编号：1004-5619（2016）03-0165-06

基金项目：上海健康医学院种子基金项目；上海高校青年教师培养资助计划项目

作者简介：吕叶辉（1989—），男，硕士，主要从事基础医学教学、科研工作；E-mail：yeyeliushu@163.com

通信作者：陈龙，男，博士，主任法医师，副教授，主要从事法医病理学及法医临床学研究；E-mail：chenlong@shmu.edu.cnPCR技术，检测死后24h内大鼠脑组织8种RNA在5℃、15℃、25℃和35℃环境下的变化规律，建立各指标与PMI之间的关系模型，以期为不同温度下早期PMI的推断提供新思路。

收稿日期：（2016-01-30）

Correlation between RNA Degradation Patterns of Rat’s Brain and Early PMI at Different Temperatures

LÜ Ye-hui1，LI Zhi-hong1，TUO Ya1，LIU Li1，LI Kun1，BIAN Jie1，MA Jian-long2，CHEN Long2
（1.School of Basic Medical Science，Shanghai University of Medicine&Health Science，Shanghai 201318，China；2.Department of Forensic Medicine，School of Basic Medical Science，Fudan University，Shanghai 200032，China）

Abstract：Objective To explore the correlation between early postmortem interval（PMI）and eight RNA markers of rat’s brain at different temperatures.Methods Total 222 SD rats were randomly divided into control group（PMI=0 h）and four experimental groups.And the rats in the experimental groups were sacrificed by cervical dislocation and respectively kept at 5℃，15℃，25℃ and 35℃ in a controlled environment chamber.The RNA was extracted from brain tissues，which was taken at 9 time points from 1 h to 24 h postmortem.The expression levels of eight markers，β-actin，GAPDH，RPS29，18S rRNA，5S rRNA，U6 snRNA，miRNA-9 and miRNA-125b，were detected using real-time fluorescent quantitative PCR，respectively.Proper internal reference was selected by geNorm software.Regression analysis of normalized RNA markers was performed by SPSS software.Mathematical model for PMI estimation was established using R software.Another 6 SD rats with known PMI were used to verify the mathematical model.Results 5S rRNA，miR-9 and miR-125b were suitable as internal reference markers for their stable expression.Both β-actin and GAPDH had well time-dependent degradation patterns and degraded continually with prolongation of PMI in 24 h postmortem.The mathematical model of the variation of ΔCt values with PMI and temperature was set up by R software and the model could be used for PMI estimation.The average error rates of model validation using β-actin and GAPDH were 14.1%and 22.2%，respectively.Conclusion The expression levels of β-actin and GAPDH are well correlated with PMI and environmental temperature.The mathematical model established in present study can provide references for estimating early PMI under various temperature conditions.

Key words：forensic pathology；RNA；postmortem intervals；temperature；degradation；rats