广东汉族人群H19基因上游差异甲基化区SNP

马晓燕，何文智，袁天丽，冼嘉嘉，王晓蔓，李少英，刘海波，黎　青（广州医科大学附属第三医院 法医物证司法鉴定所 广东省普通高校生殖与遗传重点实验室，广东 广州510150）



广东汉族人群H19基因上游差异甲基化区SNP

马晓燕，何文智，袁天丽，冼嘉嘉，王晓蔓，李少英，刘海波，黎青
（广州医科大学附属第三医院 法医物证司法鉴定所 广东省普通高校生殖与遗传重点实验室，广东 广州510150）

摘要：目的 调查广东汉族人群中H19基因上游差异甲基化区（differentially methylated region，DMR）的单核苷酸多态性（SNP）及单倍型。方法 应用PIA分型法，以限制性内切酶McrBC、HpaⅡ消化基因组DNA分别获得个体单亲源DNA模板链，经测序，分别获得个体H19基因上游DMR单亲源SNP等位基因、基因型及单倍型数据。结果 共检出13个SNP（rs10840167、rs2525883、rs12417375、rs4930101、rs2525882、rs2735970、rs2735971、rs11042170、rs2735972、rs10732516、rs2071094、rs2107425、rs4930098）及1个突变点（g7351c）。所有位点经统计学分析均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05）。除rs12417375位点DP值为0.279，其余12个SNP DP值在0.446～0.614；g7351c突变点DP值为0.013，提示为南方汉族民族特异性位点。共检出8种单倍型（命名为单倍型1～8），其中有3种为新发现的单倍型，其DP、PIC、PE及H分别为0.891、0.714、0.524和0.758。结论 PIA分型法获得的H19基因上游DMR SNP位点及其单倍型遗传标记系统具有较高的鉴别能力，在法医学鉴定中具有较好的实用价值。

关键词：法医遗传学；多态性，单核苷酸；DNA甲基化；H19基因；汉族；广东

H19基因是位于染色体11p15.5区域印记基因簇中的一个父源印记基因，其父源等位基因高度甲基化而母源等位基因未甲基化［1-4］，该印记受其上游4kb处差异甲基化区（differentially methylated region，DMR）的调控［5-7］。近年其上游DMR中SNP受法医遗传学研究的青睐。亲源印记等位基因（parentally imprinted allele，PIA）分型法可以不依赖家系分析而直接确定等位基因的亲本来源，确定个体的单倍型［8-9］，大大提高某些亲子鉴定案件（如单亲鉴定或母亲与小孩具有相同杂合子基因型）的鉴定效能［10］。目前已报道［10-13］的

1　材料与方法

1.1样本

收集广东汉族149份健康无关个体外周血样，EDTA抗凝。用QIAamp®DNA Blood Mini试剂盒（德国QIAGEN公司）提取DNA，并用NanoDrop 2000分光光度计（美国Thermo scientific公司）测定浓度。根据DNA的浓度确定扩增模板和酶切模板的量。

1.2引物

根据文献［4-6］合成扩增H19基因上游DMR的4条引物，引物特异性序列见表1，为用于后续测序，合成时在正向引物5′端加上通用引物M13F接头，反向引物5′端加上通用引物M13R接头。H19SF3和H19R4扩增产物长548bp，H19CF2和H19R7扩增产物长664bp。

表1　H19基因上游DMR特异性扩增引物序列

1.3PIA分型

1.3.1单亲源DNA模板制备

用限制性内切酶McrBC（美国NEB公司）消化基因组DNA得到149例母源DNA模板，用限制性内切酶HpaⅡ（美国NEB公司）消化基因组DNA得到149例父源DNA模板。McrBC消化反应终浓度：基因组DNA 40～1000ng，4U McrBC，1mmol GTP，1×BSA，1×Buffer；反应条件为37℃消化4h，65℃灭活10min。HpaⅡ消化反应终浓度：基因组DNA 40～1000ng，1U HpaⅡ，1×Buffer；反应条件为37℃消化4h，80℃灭活20min。

1.3.2PCR扩增

选用LA Taq®with GC buffer试剂盒（大连TaKaRa公司）在9700扩增仪（美国AB公司）上进行PCR扩增，反应体系中基因组DNA 40～1 000 ng，0.5 U LA Taq，1×GC bufferⅠ，dNTP 0.4mmol，每个片段上下游引物含量均为0.5μmol。PCR反应条件：95℃ 5min；95℃ 40 s，61℃ 40 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃10min。

1.3.3测序

对298例PIA模板（父源和母源DNA模板各149例）扩增产物进行测序分析。测序引物为通用引物M13F和M13R，测序试剂盒为BigDye Terminator v3.1（美国AB公司），具体方法参照试剂盒标准流程。测序仪器为3500遗传分析仪（美国AB公司）。

1.4统计学处理

直接计数法计算各SNP的基因型频率、等位基因频率以及单倍型频率。用PowerMaker v3.25进行Hardy-Weinberg平衡检验，计算基因频率及单倍型频率。用Modified-Powerstates软件计算个人识别率（DP）、杂合度（H）、非父排除率（PE）、多态信息含量（PIC）等群体遗传学参数。使用SPSS 13.0软件计算不同群体之间等位基因频率及单倍型频率分布的差异。

2　结果

2.1H19基因上游DMR的SNP分布及群体间差异

广东汉族149个无关个体样本中共得到298例单倍型DNA模板（父源单倍型和母源单倍型DNA模板各149例），其H19上游DMR中，共检出13个SNP（rs10840167、rs2525883、rs12417375、rs4930101、rs2525882、rs2735970、rs2735971、rs11042170、rs2735972、rs10732516、rs2071094、rs2107425、rs4930098）及1个突变点（g7351c）。其基因频率及群体遗传学参数见表2。所有位点均符合Hardy-Weinberg平衡定律（P＞0.05）。其中12个SNP的DP值为0.446～0.614，具有较高的鉴别能力，而rs12417375位点（DP值为0.279）及g7351c突变点（DP值为0.013）的鉴别能力较低。Powermaker软件分析结果显示，多个位点间处于连锁不平衡（表3）。

表2　广东汉族人群H19 基因上游DMR 中SNP 基因频率及群体遗传学参数（n=298）

表3　广东汉族人群H19 基因上游DMR 中13 个SNP 位点的连锁不平衡分析（n=298）

将广东汉族人群与已报道的其他群体的H19基因上游DMR多态性数据进行比较，广东汉族与沈阳汉族［14］、北方朝鲜族［15］人群在H19上游DMR中的13个SNP位点中，有3个位点（rs2525883、rs2735970、rs2107425）的分布存在差异（P＜0.05），而与武汉汉族［10］人群在H19上游DMR中已报道的4个SNP位点中，有2个位点（rs2525882、rs11042170）的分布存在差异（P＜0.05）。g7351c突变点在广东、武汉汉族人群中均检出，且其频率分布差异无统计学意义，而在已报道的中国其他地区与民族人群中未检见。

2.2H19基因上游DMR单倍型分布及群体间差异

298例单倍型DNA模板样本的分析结果显示，广东汉族人群H19基因上游DMR 13个SNP位点及1个突变点（g7351c）组成8种单倍型，根据其频率从高到低依次命名为单倍型1～8，单倍型序列、频率及与其他群体间的比较结果见表4～5。经计算，广东汉族H19基因上游DMR单倍型遗传标记的DP为0.891，H为0.758，PIC为0.714，PE为0.524。

表4　广东汉族人群H19上游DMR单倍型序列

表5　H19基因上游DMR单倍型频率在各群体间的比较

比较广东汉族人群与东北汉族［14］、北方朝鲜族［15］人群的H19基因上游DMR单倍型分布，发现本研究的1号单倍型在广东汉族人群中的频率比在其他2个人群中的频率高，而2号单倍型则相反，6～8号单倍型在其他两个人群中未发现。基于1～5个单倍型数据的统计学分析显示，广东汉族与沈阳汉族［14］和朝鲜族［15］的单倍型频率差异有统计学意义（P＜0.05）。

3　讨论

3.1PIA分析H19上游DMR单倍型的基本原理

H19的结构特征为PIA分型提供思路。H19基因上游DMR在父源和母源片段中发生差异甲基化，父源片段高度甲基化，母源片段未甲基化。HpaⅡ是一种甲基化敏感性限制内切酶，对哺乳动物基因组DNA CpG甲基化敏感，可以识别序列（CCGG）中非甲基化的胞嘧啶，并将其切割，而对甲基化的胞嘧啶不产生作用，因此，以HpaⅡ酶消化基因组DNA非甲基化链，而甲基化链得以保留（H19基因上游DMR父源链得以保留）。而核酸内切酶McrBC则识别甲基胞嘧啶［识别位点5′-...PumC（N40-3000）PumC...3′］，并在两个甲基胞嘧啶之间进行切割。以McrBC酶消化基因组DNA甲基化链，而非甲基化链得以保留（H19基因上游DMR母源链得以保留）。通过对单亲源链的扩增测序，即可获得人群中目的片段单倍型的数据。

3.2H19基因上游DMR中SNP位点及单倍型分布的群体间差异

H19基因上游DMR在序列号AF125183碱基位置7149～8217区域已报道的有25个SNP位点（包括11个民族特异性位点）［13-15］。其中中国人群已报道的有13个SNP位点和1个突变点（g7351c），在本研究中均全部检出。不同群体间数据比较发现，某些SNP位点在广东汉族人群与中国其他人群中的多态性分布存在差异，这些差异可能与地域、环境、生活习惯、聚居、婚配方式以及迁移历史的不同有关，也提示了对某种遗传标记进行不同人群频率调查和比对的必要性。此外，Nakayashiki等［12］指出g7351c可能为中国人群特异性位点，但除Huang等［10］早年在对武汉人群H19FR片段（约550 bp）研究中发现该突变点外，其他已报道［12，14-15］的中国（北方）群体中并未检出，提示该点可能为中国南方汉族人群特异性突变点，而本研究在149例个体中观察到1例g7351c的突变点（与Huang等［10］报道的频率一致），也进一步印证了这种观点，但鉴于样本量少，后续工作将增加样本量进行更多次减数分裂的观察研究。

经PIA分析，广东汉族人群H19基因上游DMR检出的13个SNP位点及1个突变点共组成8种单倍型（1～8号），涵盖了该区域中已报道中国人群全部SNP单倍型（1～5号）。其中，2号单倍型在广东汉族群体中的频率（0.285）比在中国北方群体中的频率（0.419）低，支持Nakayashiki等［13］提出的该单倍型频率由南自北逐渐增高，提示迁徙模式（migration-suggestive patterns）的观点。7号单倍型来源样本是McrBC酶处理后的母源单倍型，与Nakayashiki等［12］报道的3号单倍型（基于13个SNP位点）一致，该单倍型出现于蒙古、泰国、缅甸、土耳其、德国、非洲等人群［13］，而在其他亚洲地区人群中未见到，因缺乏母系样本，本研究未对该个体进行家系分析，在不考虑突变的情况下，我们猜测该单倍型可能存在个体迁徙，后续工作可追踪该个体进行家系调查，以期为迁徙模式的研究丰富数据。6号单倍型由1号单倍型的7351G到C的突变而来，提示该单倍型具有南方汉族人群特异性特征，由于未进行家系分析，所以该单倍型是否遗传给子代尚不能够确定。8号单倍型由2号单倍型的rs2107425回退突变（A到G）产生，但遗憾的是，后续的家系分析发现该单倍型并未遗传给子代。

3.3法医学应用价值和后续工作展望

印记基因遗传标记比普通二倍体遗传标记在个体识别和某些疑难亲权鉴定案例（如单亲、母子分型相同的杂合子家系以及同胞和半同胞的鉴定）中更具优势，亲缘特异性的单倍型分析可直接通过单倍型检测进行鉴定，若单倍型同源性不一致可直接排除，本研究通过计算H19基因上游DMR单倍型频率求得其DP、PIC、PE及H分别为0.891、0.714、0.524和0.758，说明该遗传标记系统在法医学鉴定中具有较好的实用价值。另外，有研究［11］表明，印记基因DMR在法医学不同组织中的甲基化模式具有差异，尤其是精液样本因精子形成过程中甲基化标记的消除或重建而表现为一个复杂的甲基化模式，会出现与其他体细胞组织相反的甲基化状态。故将不同组织与样本（尤其是生殖细胞样本）纳入PIA分型的研究是有必要的。

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（本文编辑：柳燕）

中图分类号：DF795.2

文献标志码：A

doi：10.3969/j.issn.1004-5619.2016.03.006

文章编号：1004-5619（2016）03-0184-05

基金项目：上海市法医学重点实验室开放课题（KF1305）；广州市科技计划项目（201300000095）；广东省省级科技计划项目（2013B022000023）

作者简介：马晓燕（1985—），女，硕士，主要从事法医遗传学工作及DNA多态性研究；E-mail：yalena_m@foxmail.com

通信作者：黎青，女，博士，主任法医师，硕士研究生导师，主要从事法医物证学鉴定和研究；E-mail：81292522@163.comH19基因上游DMR中共有25个SNP（其中11个具有民族特异性的突变点）及21种单倍型，这些SNP及单倍型在人群中的分布存在地区及种族的差异性［13-15］。本研究用PIA分型法分别制备广东汉族群体H19基因上游DMR中的父源和母源DNA模板链，结合DNA测序技术检测其父源和母源SNP等位基因，调查该群体中H19基因上游DMR的SNP位点、单倍型的遗传多态性及群体遗传学参数，为PIA分型在法医学中的应用提供基础遗传数据。

收稿日期：（2015-10-16）

SNP in Differentially Methylated Region Upstream of H19 Gene in Guangdong Han Population

MA Xiao-yan，HE Wen-zhi，YUAN Tian-li，XIAN Jia-jia，WANG Xiao-man，LI Shao-ying，LIU Hai-bo，LI Qing
（Key Laboratory of Reproduction and Genetics of Guangdong Higher Education Institutes，Institute of Forensic Identification，the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangdong 510150，China）

Abstract：Objective To investigate the single nucleotide polymorphism （SNP）and haplotypes in differentially methylated region（DMR）upstream of H19 gene in Guangdong Han population.Methods The PIA typing and restriction enzyme McrBC and HpaⅡ were used to digest the genomic DNA and obtain the individual uniparental DNA template strand.The data of uniparental SNP alleles，genotypes and haplotypes in DMR upstream of H19 gene were obtained by sequencing.Results A total of 13 SNPs（rs10840167，rs2525883，rs12417375，rs4930101，rs2525882，rs2735970，rs2735971，rs11042170，rs2735972，rs10732516，rs2071094，rs2107425，and rs4930098）and one mutation locus（g7351c）were found.All loci followed the Hardy-Weinberg equilibrium （P＞0.05）by statistical analysis.Except for rs12417375（DP=0.279）locus，the DP of remaining 12 SNPs were 0.446-0.614，and the g7351c mutation locus（DP=0.013）was the particular loci of the Southern Chinese Han population.Eight haplotypes（designated as haplotype 1-8）were detected，in which 3 haplotypes had not yet been reported and the DP，PIC，PE and H were 0.891，0.714，0.524 and 0.758，respectively.Conclusion Obtained by PIA typing，the SNP in DMR upstream of H19 gene and its haplotypes genetic marker system have a high determination power and show a good practical value in forensic identification.

Key words：forensic genetics；polymorphism，single nucleotide；DNA methylation；H19 gene；Han nationality；Guangdong