黄精地龙方对体外培养分化的SH-SY5Y细胞Aβ25-35损伤中的保护作用研究

肖移生，曾元凤，侯吉华，李　青

(1. 江西中医药大学基础医学院，江西 南昌 330004；2. 江西省人民医院，江西 南昌 330006)



论著

黄精地龙方对体外培养分化的SH-SY5Y细胞Aβ25-35损伤中的保护作用研究

肖移生1，曾元凤2，侯吉华1，李青1

(1. 江西中医药大学基础医学院，江西 南昌 330004；2. 江西省人民医院，江西 南昌 330006)

[摘要]目的探讨黄精地龙方(RPEWM) 对体外培养分化的SH-SY5Y细胞Aβ25-35损伤的影响。方法SH-SY5Y细胞经维甲酸诱导分化，再经Aβ25-35造成细胞老年痴呆(AD)损伤，观察不同浓度RPEWM提取液对损伤后的细胞形态学、细胞增殖情况及培养液中MDA、LDH含量，细胞中SOD、GSH-Px活性和细胞内游离钙含量、Caspase-3酶活性的影响。结果RPEWM提取液在10～125 mg/L浓度范围内能明显抗细胞AD损伤，促进细胞增殖；RPEWM提取液30，60，90 mg/L均能明显降低MDA、LDH含量及细胞内钙离子、Caspase-3酶活性，升高细胞内SOD、GSH-Px酶活性，且呈剂量依赖性。结论RPEWM对分化的SH-SY5Y细胞Aβ25-35损伤有良好的保护作用，对AD有一定治疗作用。

[关键词]黄精地龙方；SH-SY5Y细胞；Aβ25-35；老年痴呆

老年痴呆(Alzheimer’s disease，AD) 是严重危害广大老年人身心健康的常见病、多发病之一，但至今临床医疗尚缺乏特异性、高效性治疗药物，因此从我国中医药中开发具有脑神经细胞保护的药物具有十分重要的意义。黄精地龙方(Rhizoma Polygonati and Earth Worm Mixtures，RPEWM)系本课题组依据中医理论自创方，前期研究发现该方具有明显抗大鼠及小鼠老年痴呆作用[1-2]。为进一步阐述该方对体外培养的神经细胞是否具有保护作用，本研究以人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)经维甲酸诱导分化，再经Aβ25-35致细胞AD损伤，探讨RPEWM抗神经细胞损伤机制。

1实验资料

1.1药物RPEWM由黄精、地龙两味中药按1∶1组成。黄精与地龙均购自江西中医药大学第一附属医院门诊中药房，并经江西中医药大学中药生药教研室鉴定地龙属于广地龙、黄精属于多花黄精，且均符合国家中药临床应用标准。人参皂甙Rb1标准品购自中国药品生物制品检定所 (纯度≥99.9%)。RPEWM浓缩提取液制备[3]：将黄精100 g、地龙100 g用超微粉碎机粉碎后，常温下将黄精、地龙粉以1∶1比例混合，加1 000 mL蒸馏水浸渍，不时搅拌使其充分浸泡12h；沸水回流2h，滤过，收集提取液，向粗滤后的残渣内再加1 000 mL蒸馏水(100 ℃)，并再次沸水回流1 h，滤过，收集提取液；合并2次提取液后离心(2 000 r/min，20 min)，收集上清液，旋转蒸发浓缩形成200 mL浓缩液(每1 mL相当含生药1 g)为实验用的RPEWM浓缩提取液，过滤除菌，-20 ℃保存备用。

1.2试剂胎牛血清及DMEM/F12培养基为Gibco公司产品；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px) 检测试剂盒均为福建迈新生物技术公司产品；胰蛋白酶、全反式维甲酸、Aβ25-35、四甲基偶氮唑盐(MTT)、Fura-2/Am 均为Sigma公司产品；钙离子浓度校正试剂盒为Invitrogen公司产品；Caspase-3检测试剂盒为Biovision公司产品；其余试剂均为国产分析纯级试剂。

1.3仪器752分光光度计为上海医用分析仪器厂产品，多功能热回流中药提取浓缩机为上海定泰蒸发器有限公司产品，荧光分光光度计及酶标仪为美国THERMO FISHER公司产品，其他均为常用仪器。

1.4SH-SY5Y细胞培养SH-SY5Y细胞购自中国科学院上海细胞(库)中心，以5.0×104mL-1细胞浓度置于含15%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培养液中培养，用于后续实验。

1.5AD细胞模型建立参照文献[4-5]方法，SH-SY5Y细胞接种培养24 h后，加入终浓度为1 μmol/L的全反式维甲酸处理细胞3 d来诱导其分化，再加入10 μmol/L的Aβ25-35作用细胞48 h，建立AD细胞模型。

1.6细胞增殖率测定采用MTT法测定。细胞置于96孔培养板内培养，经维甲酸诱导分化后，分成正常组、损伤组、人参皂甙组、RPEWM提取液组(包括9个浓度组)。RPEWM提取液组加入Aβ25-35处理的同时，分别加入1，5，10，25，50，75，100，125，150 mg/L的RPEWM提取液保护，继续培养48 h后行MTT法检测，以寻找药物的有效浓度范围，得出量效关系；人参皂甙组加入Aβ25-35处理的同时加入人参皂甙Rb1(终浓度为50 mg/L) 保护；损伤组只加入Aβ25-35处理；正常组经维甲酸诱导分化后不加Aβ25-35，也不加药物保护。每组细胞10个复孔，且实验重复10次。到时间点后，各孔加入MTT液20 μL/孔，4h后终止培养，弃去上清，加入DMSO(100 μL/孔)，振荡使结晶物溶解，用自动酶标仪波长570 nm处测吸光度值(D570)，以D值高低表示细胞活力的高低。

1.7MDA、LDH含量及SOD、GSH-Px活性测定细胞置于24孔培养板内培养，待细胞分化好后，分成正常组、损伤组、人参皂甙组、RPEWM 30 mg/L组、RPEWM 60 mg/L组、RPEWM 90 mg/L组(根据MTT检测结果得出RPEWM提取液的有效浓度范围分组)，培养方法同1.6。到时间点后，收集各组各孔内的培养液，定量取部分培养液按试剂盒说明书操作进行MDA、LDH含量测定。细胞用PBS漂洗2遍，每孔加入含0.05 mmol/L EDTA的PBS 200 μL(pH 8.0)，再加入1%的Triton-X100 100 μL，将培养板置于振荡器振荡2 min使细胞裂解并溶解，然后加入25% H3PO4100 μL以沉淀蛋白，低温离心(10 000 r/min)30 min，取沉淀物按说明书测定SOD、GSH-Px活性。蛋白质定量用Lowry法。

1.8细胞内游离钙([Ca2+]i)含量、Caspase-3酶活性测定 用20 mL培养瓶培养细胞，其余过程及实验分组同SOD、LDH、MDA、GSH-Px测定实验。到时间点后，收集各组细胞分别制备成1×109mL-1的细胞悬液。

1.8.1[Ca2+]i含量测定各组分别取100 μL细胞悬液置于96孔培养板内，加入终浓度为2 μmol/L的Fura-2/Am，于37 ℃恒温振荡40 min；再用荧光分光光度计进行荧光测定，游离时Fura-2的激发波长为340 nm，结合Fura-2的激发波长为420 nm，分别测定这两个波长下的荧光强度，求出其比率(R)。再按公式[Ca2+]i = Kd(R-Rmin)/(Rmax-R) 计算各组细胞内[Ca2+]i的含量，Kd为224 nmol/L，Rmin为最小荧光值(由悬液内加入EDTA后的测量值)，Rmax为最大荧光值(由悬液内加入1% Triton-X100后的测量值)。

1.8.2Caspase-3活性测定各组分别取100 μL细胞悬液置于96孔培养板内，在每孔中依次加入80 μL检测缓冲液，10 μL待测样品蛋白，10 μL AcDEVD-PNA(2 mmol/L)，37 ℃孵育4 h，上酶标仪于405 nm波长处检测各组细胞的Caspase-3活性，详细步骤见检测试剂盒说明书。蛋白质定量用Lowry法。

2结果

2.1细胞形态学观察SH-SY5Y细胞具有类神经细胞(元) 形态，但突起少、短，不长于胞体。经维甲酸诱导1 d后细胞形态发生改变，胞体上伸出多突起；3 d后分化为神经细胞样形态更明显，突起更多、更长，且有分支，分支之间有相连。分化细胞经Aβ25-35处理48 h后损伤较明显，细胞折光性差，胞体变圆，突起回缩，突起间的网状连结消失，培养液中有较多漂浮细胞。RPEWM 1 mg/L及5 mg/L组的细胞形态也较差，与损伤组的细胞形态相似。10 mg/L以上的RPEWM提取液能减轻细胞损伤，细胞生长良好，突起伸展长，漂浮细胞不明显，且药物的保护作用随剂量增加越明显。

2.2MTT检测结果正常组吸光度为0.743±0.041，损伤组为0.333±0.036，人参皂甙组为0.672±0.053，RPEWM 1，5，10，25，50，75，100，125，150 mg/L各组吸光度分别为0.318±0.018，0.366±0.010，0.515±0.044，0.538±0.057，0.642±0.058，0.681±0.049，0.697±0.064，0.725±0.059，0.717±0.060。RPEWM 1 mg/L及5 mg/L组的细胞增殖率与损伤组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；RPEWM 10 mg/L以上组的细胞增殖率均高于损伤组(P均<0.05)，且随剂量增加，细胞增殖率越高，AD细胞保护作用越明显；RPEWM 125 mg/L组的细胞增殖率最高，150 mg/L组的细胞增殖率不再升高，说明此浓度进入药效曲线平台。故后续实验中，将RPEWM提取液浓度设为30，60，90 mg/L 3个剂量组。

2.3各组MDA、LDH含量和SOD、GSH-Px活性比较损伤组培养液中MDA、LDH含量均明显高于正常组(P均<0.05)，细胞中SOD、GSH-Px活性均明显低于正常组(P均<0.05)。RPEWM各组培养液中MDA、LDH含量明显低于损伤组(P均<0.05)，细胞中SOD、GSH-Px活性明显高于损伤组(P均<0.05)，且呈剂量依赖性。见表1。

表1　各组MDA、LDH含量和SOD、GSH-Px活性比较

注：①与正常组比较，P<0.05；②与损伤组比较，P<0.05。

2.4各组细胞内[Ca2+]i含量、Caspase-3活性比较损伤组细胞内[Ca2+]i含量及Caspase-3活性均明显高于正常组(P均<0.05)；RPEWM各组细胞内[Ca2+]i含量及Caspase-3活性均明显低于损伤组(P均<0.05)，且呈剂量依赖性。见表2。

表2　各组细胞内[Ca2+]i含量、Caspase-3

注：①与正常组比较，P<0.05；②与损伤组比较，P<0.05。

3讨论

AD等脑髓病其实质是脑神经细胞受到各种损伤因子影响，最终导致神经细胞死亡，从而出现不同的临床症状。已有研究证实Aβ是各种原因诱导AD的共同通路，可导致神经细胞变性、神经纤维缠结、神经细胞死亡；而Aβ25-35是Aβ主要活性片段，其神经毒性已被大量研究证实[6]。因此，抗Aβ导致的神经细胞损伤可作为AD治疗关键。SH-SY5Y细胞来源于人神经母细胞瘤，其某些生理功能及生物学特性与正常神经元有相似之处，再经维甲酸诱导后能分化为神经细胞[4]。

本研究MTT检测结果显示，10 mg/L以上的RPEWM提取液能提高AD细胞增殖率，显示出良好的抗Aβ25-35致神经细胞AD损伤作用，且随药物浓度增加，细胞保护作用越明显。当RPEWM提取液浓度达125 mg/L时，其药效达到顶峰，由此得出RPEWM提取液抗神经细胞AD损伤的有效剂量范围在10～125 mg/L。

各种自由基是损伤体细胞的重要因子，尤其是氧自由基，能使线粒体膜的多不饱和脂肪酸(PUTA) 过氧化，损伤其结构与功能，引发能量代谢障碍，最终导致细胞功能障碍。MDA是PUTA过氧化的分解物，可间接反映自由基对细胞的损害程度。细胞内有大量的LDH，很少漏出细胞外，但当细胞受损后，LDH漏出量显著升高，故检测细胞外液中的LDH量可反映细胞受损程度。SOD是一种自由基清除酶，其活性高低可以反映细胞对自由基的清除能力。GSH-Px是细胞内抗脂质过氧化的一种重要酶，它能特异性催化GSH对H2O2的还原反应，保护细胞膜结构和功能的完整，其活性强弱也可以反映细胞抗氧化能力的大小。本实验结果显示，Aβ25-35致细胞AD损伤后培养液中MDA、LDH含量显著升高，细胞中SOD、GSH-Px活性显著降低；RPEWM各组培养液中MDA、LDH含量显著降低，细胞中SOD、GSH-Px活性显著升高，且呈剂量依赖性，说明RPEWM能增加细胞自由基清除能力，抑制脂质过氧化，减少单胺类神经递质的氧化分解，从而发挥抗神经细胞损伤作用。这与文献[3-4]结果相一致，进一步证实了RPEWM抗自由基、抗氧化及神经保护作用的有效性、稳定性和可重复性。

细胞内的钙离子主要由细胞膜上的电压依赖性钙通道、钙泵耗能来维持，当细胞受损伤时，线粒体能量代谢障碍，钙泵不能主动把细胞内的钙泵出细胞外；另外，脂质过氧化也会促使电压依赖性钙通道开放，进而钙离子内流，引发钙超载[7]。细胞内过量的钙离子是引发细胞凋亡的始动因子之一，启动核酸内切酶，引起凋亡相关基因表达，最终激活Caspase-3，导致细胞凋亡。本研究中发现Aβ25-35致细胞AD损伤后细胞内钙离子含量明显增加，Caspase-3活性显著升高；RPEWM提取液能明显降低细胞内钙离子含量及Caspase-3活性，抑制Aβ25-35致细胞AD损伤后的细胞坏死或凋亡发生。

综上所述，Aβ25-35致神经细胞AD损伤会引起细胞内自由基大量增加，脂质过氧化、细胞内钙离子超载，进而引发神经细胞坏死或凋亡；RPEWM有良好的抗神经细胞AD损伤作用，其机制与抗自由基、抗氧化、抗钙超载、抗凋亡等有关。

[参考文献]

[1]肖移生，曾元凤，徐玥璟，等. 黄精地龙方抗老年痴呆小鼠的研究[J]. 中药药理与临床，2013，29(2):152-154

[2]肖移生，曾元凤，欧阳厚淦，等. 黄精地龙方对老年痴呆大鼠行为认知及脑胆碱能系统的影响[J]. 中药药理与临床，2013，29(4):146-148

[3]肖移生，侯吉华，伍庆华，等. 地龙对大鼠大脑局灶性脑缺血损伤保护作用研究[J]. 中药药理与临床，2009,25(6):62-64

[4]Joanna A,Ronald E,Eva B,et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling[J]. PloS One,2013,8(5):1-17

[5]佟海侠，张继红，陆春伟，等. 全反式维甲酸体外诱导神经母细胞瘤细胞分化的实验研究[J]. 中国医学工程，2007，15(1)：37-42

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Protective effects of Rhizoma Polygonati and Earth Worm Mixtures on the damage of Aβ25-35 to the differentiated SH-SY5Y cells

XIAO Yisheng1, ZENG Yuanfeng2, HOU Jihua1, LI Qing1

(1. The Basic Medicine College of Jiangxi University of TCM, Nanchang 330004, Jiangxi, China; 2. Jiangxi Province People’s Hospital, Nanchang 330006, Jiangxi, China)

Abstract:Objective It is to observe the functions of Rhizoma Polygonati and Earth Worm Mixtures (RPEWM) on the damage of Aβ25-35 to the differentiated SH-SY5Y cells. Methods The SH-SY5Y cells were differentiated to neuron by ATRA, then they were impaired by Aβ25-35 as the Alzheimer’s disease (AD) injury to cells, at the same time, the extraction of RPEWM were added to cells act as protector. Finally, we investigated the morphological behavior, survival rate, detected the SOD, LDH, MDA, GSH-Px levels, observed the intracellular calcium levels ([Ca2+]i), Caspase-3 activites of the AD model’s cells. Results Compared with model group, the extraction of RPEWM at the dose of 10-125 mg/L could significantly anti-AD impair to neuron cells, increase the cell viability and survival rate. Also, the extraction of RPEWM at the dose of 30, 60, 90 mg/L could decrease the [Ca2+]i, MDA, LDH level, lower Caspase-3 activites, and activate SOD, GSH-Px activites of the AD model’s cells. Conclusion RPEWM possess the function of anti-AD, can effectively protect the differentiated SH-SY5Y cells against AD impairment which exerted by Aβ25-35.

Key words:The Rhizoma Polygonati and Earth Worm Mixtures; SH-SY5Y cell; Aβ25-35; Alzheimer’s disease

[作者简介]肖移生，男，硕士，副教授，研究方向为中药抗衰老、抗肿瘤研究。 [通信作者]侯吉华，E-mail：794706902@qq.com

[基金项目]2014年江西省卫生计生委中医药科研基金项目(2014A014)

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.20.001

[中图分类号]R-33

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)20-2167-04

[收稿日期]2016-01-17