紫茉莉乙醇提取物对二斑叶螨生物酶活性的影响

赵赫南, 雷　廷, 李　冰, 曹永昶, 任　航, 韩俊艳

(沈阳大学 城市有害生物治理与生态安全辽宁省重点实验室, 辽宁 沈阳　110044)



紫茉莉乙醇提取物对二斑叶螨生物酶活性的影响

赵赫南, 雷廷, 李冰, 曹永昶, 任航, 韩俊艳

(沈阳大学 城市有害生物治理与生态安全辽宁省重点实验室, 辽宁 沈阳110044)

摘要:为探讨紫茉莉乙醇提取物杀二斑叶螨作用机制,研究了紫茉莉乙醇提取物(MEE)对几种生物酶活性的影响.以MEE最大可耐受剂量1.2 mg/mL采用触杀法处理雌成螨,分别在处理后4、8、12、16、20、24 h后测定酶活性变化.处理组螨的蛋白酶活性、酯酶活性及Na+, K+-ATP酶活性均呈持续下降状态,谷胱甘肽巯基转移酶(GST)活性呈先上升后下降状态,在24 h内活性均高于对照组.试验结果表明,MEE对二斑叶螨的几种酶活性产生影响,提示其杀螨作用机制与这些酶有关.

关键词:生物农药; 杀螨剂; 谷胱甘肽巯基转移酶; Na+, K+-ATP酶; 蛋白酶

二斑叶螨(Tetranychus urticae)是一种危害严重的农林业害虫,在我国各地均有存在.传统上对二斑叶螨的控制依赖于化学农药,但二斑叶螨对化学农药易产生抗药性,这与其繁殖能力强、世代周期短有关[1].近年来,植物杀螨剂的研究得到关注,一些植物含有黄酮类、生物碱类等次生代谢物质,这些次生代谢物质可用来防御病虫害抑制种群增长,次生代谢物质一般作用较为缓慢,害虫对其不易产生耐药性,而且次生代谢物质对环境污染往往较轻,因而开发植物杀螨剂具有很好的前景[2].

紫茉莉(Mirabilis jalapaL.)又名胭脂花、粉子头,是一种生态适应广、生长速度快、繁殖力强的植物,在我国多地有栽培[3].笔者在前面的筛选研究中发现紫茉莉乙醇提取物(Mirabilis jalapaLethanolextracts,MEE)对二斑叶螨雌成螨具有杀螨活性[4].为探讨杀螨作用机制,本文研究了MEE对二斑叶螨几种生物酶活性的影响.

1材料与方法

1.1材料

MEE的制备.试验所用紫茉莉植物采于沈阳大学及其周边绿地,经洗净、阴干、粉碎、过80目筛,制成粉末.取粉末20g,按1∶10加入无水乙醇浸泡提取,每3d一次,共提取3次,合并浸提液,过滤,用旋转蒸发仪浓缩提取物,经真空干燥,将提取物用乙醇配制成10mg/mL的供试药液,备用.

二斑叶螨.来自沈阳大学辽宁省城市有害生物治理与生态安全重点实验室,在智能人工气候箱中饲养.饲养条件:光照为16h(L)∶8h(D),温度为(25±1) ℃、相对湿度为60%～65%,.

1.2方法

(1) 雌成螨最大耐受量测定.将双面胶带粘贴于载玻片一端,用毛笔挑取雌成螨,将其背部粘在双面胶带上,每片粘雌成螨30只.将供试MEE用水分别稀释成2.0、1.6、1.2、0.8mg/mL,分别相当于50%、40%、30%与20%LD50剂量.将附有雌成螨的载玻片浸入待测药液或空白对照溶液(体积分数1%乙醇水溶液),5s后取出,用吸水纸条小心吸去多余药液[1].24h后检查结果,以最大不出现死亡质量浓度为最大耐受剂量.

(2) 酶源制备.以成螨触杀毒力测定得到最大耐受量(1.2mg/mL),采用触杀法处理雌成螨,分别在处理后4、8、12、16、20、24h后取活螨150只,用水冲洗,经滤纸吸干,转移至组织匀浆器,加0.04mol/LpH值为7.0的磷酸缓冲液1.5mL,匀浆,匀浆液离心10min,取上清液,稀释至1/20,即为工作酶液.采用Bradford法测定蛋白含量[1].

(3) 蛋白酶(proteinase)活性测定.取工作酶液0.05mL,37 ℃水浴3～5min,加1mL酪蛋白溶液,混匀,37 ℃水浴中15min,加体积分数10%三氯乙酸3mL,离心,取上清液1mL,加0.5mol/L碳酸钠5mL,Follin-酚试剂1mL,显色15min,于波长680nm处测光密度值,通过标准曲线确定酶活力[5].

(4) 谷胱甘肽巯基转移酶(glutathioneS-transferase,GST)活性测定.依据Clark等方法测定[6].

(5)Na+,K+-ATP酶活性测定.采用钼蓝测磷法测定[7].

(6) 酯酶(Esterase)活性测定.依据酯酶可催化α-醋酸萘酯水解成α-萘酚反应原理测定[8].

(7) 数据处理.实验数据用SSPS11.5软件进行统计分析,用Tukeytest进行组间比较.

2结果

2.1确定最大耐受量

为寻找二斑叶螨对MEE的最大耐受量,测定了不同剂量MEE对二斑叶螨的致死率,试验结果见表1,在剂量小于30%LD50,24h的触杀率为0,30%LD50可以认为是最大耐受剂量.本文在后面的酶学试验中,采用30%LD50剂量处理二斑叶螨,用于生物酶源制备.

表1　　　　不同剂量紫茉莉乙醇提取物

2.2MEE对蛋白酶活性的影响

蛋白酶是生物体内的主要消化酶系,它的活性直接影响生物体对食物的吸收和利用.试验结果见图1,用MEE提取物处理二斑叶螨后,蛋白酶活性变化呈下降趋势,在处理12h后处理组与对照组有显著差异.上述结果表明MEE影响到二斑叶螨的消化功能,可能导致二斑叶螨因消化不良而死亡.

图1　　　　紫茉莉乙醇提取物对二斑叶螨雌成螨

2.3MEE对GST活性的影响

GST广泛存在于昆虫组织内,是催化毒物及其代谢物与还原型谷胱甘肽(GSH)轭合反应的酶,GST活性变化往往表明虫体受到毒物的作用,因而GST常被用作组织损伤的敏感指标[9].本研究中,MEE处理初期引起GST活性升高,到第12h达到最大值,表明螨的解毒能力加强;随着时间的延长,GST活性下降,这可能是由于毒性作用的累积,螨的解毒机能下降的结果(图2).

图2　　　　紫茉莉乙醇提取物对二斑叶螨雌成螨

Na+,K+-ATP酶是一种离子泵,可以将细胞兴奋后内流的Na+排出,使膜电位恢复到静息状态.抑制该酶活性,会使Na+外排受抑制,胞内Na+含量升高,神经细胞处于持续的兴奋状态,最终导致昆虫死亡,Na+,K+-ATP酶是拟除虫菊酯类杀虫剂的靶标位点之一[10].本研究中,MEE持续抑制了Na+,K+-ATP酶的活性,表明其对螨具有毒性作用(图3).

图3　　　　紫茉莉乙醇提取物对二斑叶螨雌成螨Na+,

2.5MEE对酯酶活性的影响

害虫酯酶通过分解或与有毒物质螯合,可使外源性毒物无法达到靶标部位,从而对杀虫剂产生解毒作用或抗性,通过抑制酯酶的活性可以增加杀虫剂的毒力,胡椒基丁醚与磷酸三苯酯即通过雌机制发挥作用[11].本研究中,MEE导致酯酶活性下降,在8h以后与对照组比较具有显著差别(p<0.05),提示抑制酯酶活性也参与了MEE的杀螨作用机制(图4).

图4　　　　紫茉莉乙醇提取物对二斑叶螨雌成螨

3讨论

紫茉莉为传统中草药,中医认为紫茉莉性寒、味甘,可用于赤白带下、关节肿痛、痈疮肿毒、热淋、白浊、水肿等症,根、叶、种子和花均可入药;现代药理研究证明紫茉莉有抗癌、抑菌、降血糖及利尿等作用[3].

近年来,紫茉莉在植物保护方面的研究得到重视.彭跃峰等研究了紫茉莉茎提取物及其萃取物对菜粉蝶幼虫的生物活性,结果表明,紫茉莉茎氯仿提取物的毒杀与拒食效果最好.紫茉莉茎提取物对小菜蛾(Plutella xylostellaL.)、斜纹夜蛾(ProdenialituraFabr.)也有较好的抑制作用[12-13].紫茉莉提取物对一些害虫具有拒食作用,紫茉莉可驱避和麻醉蚊虫,可制成蚊香[14].近年的研究也发现紫茉莉具有抗植物病害作用[15-16].

目前国内外对紫茉莉的化学成分的研究报道较多. 早期研究认为紫茉莉根含有甜菜素、氨基酸、有机酸、三萜、甾体、脂肪酸、葫芦巴碱和半乳糖等.近年来很多活性成分被发现, 邝嘉乐从紫茉莉根中分离得到大黄酚、豆甾醇与两种鱼藤酮类化合物[17],Wang等也在紫茉莉中发现了类鱼藤酮化合物[18]. 来国防等从黄花紫茉莉得到7个类鱼藤酮化合物, 并发现了1个异喹啉生物碱[19]. 类鱼藤酮化合物与其他生物碱类活性成分的发现, 为紫茉莉的杀虫杀螨活性提供了物质基础.

蛋白酶、酯酶以及GST都是昆虫体内重要的代谢解毒酶系[20-21],作为一个有机的整体,虫体在外源的有毒物质进入体内时,会调动所有的资源进行解毒,从而保护生命活动的正常进行,而一些药物通过对解毒酶抑制发挥杀虫作用,本研究中一些酶活性的下降反映出紫茉莉乙醇提取物的毒性作用.由于虫体对外源性物质的可能发生适应性变化,有些酶活性可能会升高,本研究中GST酶活性的升高可能反映出虫体的适应性变化.

4结论

本试验研究中,紫茉莉乙醇提取物处理的二斑叶螨蛋白酶、酯酶、GST及Na+,K+-ATP酶活性都发生了改变,反映出了药物的毒性与虫体的适应性变化,但这些酶活性的变化是药物对酶的直接作用,还是由于虫体反应而出现的间接作用,尚待进一步研究.

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【责任编辑: 李艳】

EffectofMirabilis jalapaEthanolExtractsonEnzymesofTetranychus urticae

Zhao Henan, Lei Ting, Li Bing, Cao Yongchang, Ren Hang, Han Junyan

(LiaoningKeyLaboratoryofUrbanIntegratedPestManagementandEcologicalSecurity,ShenyangUniversity,Shenyang110044,China)

Abstract:For elucidating the mechanisms of Mirabilis jalapa ethanol extracts (MEE) killing Tetranychus urticae, effects of MEE on enzyme activities of Tetranychus urticae were determined. The maximum tolerable dose of 1.2 mg/mL MEE were used to treat female adult Tetranychus urticae, the enzyme activities were measured after 4, 8, 12, 16, 20 and 24 h, respectively. The enzyme activities of proteinase, Na+, K+-ATPase and esterase decreased in all the checkpoints, and glutathione S-transferase activity increased firstly and decreased latterly. The results demonstrated that MEE affected the enzyme activities of Tetranychus urticae, which may involve in the mechanisms of MEE killing Tetranychus urticae.

Key words:biological pesticide;acaricide; glutathione S-transferase; Na+, K+-ATPase; proteinase

文章编号:2095-5456(2016)03-0198-05

收稿日期:2015-12-17

基金项目:辽宁省自然科学基金资助项目(2014020100).

作者简介:赵赫南(1990-),男,辽宁沈阳人,沈阳大学硕士研究生; 韩俊艳(1968-),女(蒙古族),内蒙古赤峰人,沈阳大学副教授,博士.

中图分类号:S 482.39

文献标志码:A