微波法提取苹果皮类黄酮及其抗氧化性研究* 1

黄　庆，张河辉，吴笑臣，张熊禄

(赣南师范学院 化学化工学院，江西 赣州　341000)



微波法提取苹果皮类黄酮及其抗氧化性研究* 1

黄庆，张河辉，吴笑臣，张熊禄†

(赣南师范学院 化学化工学院，江西 赣州341000)

摘要：以苹果皮为原料，采用微波法及单因素试验，黄酮类化合物提取率为考察指标，优选其最佳提取工艺；并以Trolox作为参照，对提取化合物进行抗氧化性实验研究.结果表明：最佳提取工艺条件是溶剂60%乙醇，料液比1∶5(g/mL)，微波功率390 w，提取时间2 min，黄酮类化合物的提取率可达2.50%.且苹果皮渣黄酮类化合物对GO·的清除率随其浓度的增大而增大，最大清除率达到25.2%，说明目标物质对机体内自由基有较好的清除能力.

关键词：黄酮类；苹果皮；微波；Galvinoxyl自由基；Trolox；抗氧化

防衰老，抗衰老功能的研究是当前食品研究的重要领域，根据抗衰老自由基生物的理论，抗氧化能力成为抗衰老活性添加物筛选的主要依据[1-2]，如何从天然植物资源中提取出具有抑制自由基氧化能力的活性物质是当前化学研究领域的热点之一[3-4].

苹果中富含黄酮类、多酚类、色素类等多种有重要作用的化学活性成分，且是我国四大水果之首，世界产量第一，营养丰富，人们喜爱的水果之一.其中苹果中黄酮类化合物是优良天然抗氧化剂，具有良好的生物和药理活性[5-6]，有抗氧化、抗菌、增强骨质、防辐射、抗动脉硬化，还可以预防肿瘤、心血管疾病等作用，且对人的身体没有毒害作用[7-12].因此，开发和利用苹果黄酮类化合物有着很好的实用价值. 苹果皮渣或未成熟苹果是废弃物，如果不进行综合开发利用，最大可能提取出这些所含丰富的黄酮类、多酚类、色素类等活性化合物，不仅浪费了宝贵的资源，还有污染环境的潜在危害. 近来年，关于苹果中多酚的提取及抗氧化活性的研究较多，但是对苹果皮中的黄酮类化合物及其抗氧化性的测定研究较少.

1材料与方法

1.1原料和试剂

新鲜苹果,市售，产地为山东威海；Galvinoxyl自由基东京仁成工业株式会社，Trolox Sigma-Aldrich(st.Louis,MO)，无水乙醇(分析纯)江苏强盛功能化学股份有限公司.

1.2主要仪器设备

UV-7504型紫外可见分光光度计，上海精科实业有限公司；MCR-3型微波炉上海捷呈仪器有限公司；NB-XZ20型旋转蒸发仪，郑州南北仪器设备有限公司，电子天平，上海良平仪器仪表有限公司；WBE-SDJ型电热恒温鼓风干燥箱，东莞市威邦仪器股份有限公司.

1.3实验方法

1.3.1苹果皮中的黄酮类提取流程

用果刀削新鲜苹果皮，再用果刀将大块的苹果皮渣切成若干块，紧接着称取一定质量的苹果皮渣，然后用乙醇溶液做溶剂，在微波炉中回流提取3次，最后用旋转蒸发仪得到苹果皮渣黄酮类浓缩液.

1.3.2单因素对黄酮类提取率的影响

在不同的实验条件下，进行3次重复实验取平均值，分别考察回流时间、料液比、微波炉功率及溶剂浓度4个因素对黄酮类提取率的影响，并用紫外可见分光光度计测定其提取液的吸光度.4因素实验设计如下：每组称取2.07 g的苹果皮渣，固定溶剂浓度60%的乙醇，微波功率390 W，料液比1∶5，分别回流1 min、2 min、3 min、4 min、5 min.每组称取2.07 g的苹果皮渣，设定回流时间2 min，微波功率390 W，溶剂浓度60%的乙醇，料液比(g/mL，下同)分别为1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8.每组称取2.04 g的苹果皮渣，固定料液比1∶5，回流时间2 min，溶剂浓度60%的乙醇，分别用微波功率为130 W、260 W、390 W、520 W、585 W进行微波加热.每组称取2.06 g 苹果皮渣，设定回流时间2 min，微波功率390 W，料液比1∶5，分别选择40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇及水作为溶剂.

1.3.3苹果皮渣黄酮类提取液的处理

在最佳工艺的条件下，收集所得到提取液，然后通过旋转蒸发仪进行浓缩，收集滤液定容至50 mL，放在冰箱中储存待用.

1.3.4苹果皮渣黄酮类化合物的定量测定方法

苹果皮渣黄酮类跟葛根中黄酮类的结构相似，苹果皮渣黄酮类的含量的测定参照文献[11]方法进行，紫外可见分光光度波长选择249 nm.

1.3.5苹果皮渣黄酮类化合物清除GO·能力的测定

参照文献[12]方法，实验以Trolox为标准参照物，紫外可见分光光度波长选择428 nm，绘制Trolox浓度对GO·的清除率工作曲线并建立回归方程.根据工作曲线及回归方程，计算和评价苹果皮渣黄酮类对GO·相对清除能力.

图1　葛根素标准曲线

图2　回流时间对苹果黄酮类提取率的影响

图3　料液比与黄酮类提取率的影响

2结果与分析

2.1葛根素标准曲线回归方程的建立

称取5.05 g葛根素样品，溶于无水乙醇中，定容至250 mL，做标准储备溶液.分别吸取0.00 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL的标准储备溶液至25 mL比色管中，并用无水乙醇定容，配制成不同浓度(浓度分别为0、0.404、0.808、1.21、1.62、2.02 mg·mL-1)的标准溶液，在249 nm处测定葛根素不同浓度的吸光度，绘制葛根素工作曲线见图1：

建立回归方程为y=0.576x-0.012，R2=0.999,y表示葛根素的吸光度，x表示葛根素的浓度.

此方程可以用来测定提取的黄酮类的浓度.经测定和换算，提取的黄酮类浓缩液的浓度为4.23 mg/mL.

2.2苹果皮渣回流时间对苹果黄酮类提取率的影响

分别对不同回流时间苹果皮渣的提取液在紫外可见分光光度计中测量吸光度.经过换算处理得到回流时间与提取率的关系图(图2).

由图2可知，黄酮类提取率随回流时间的增加而提高，后又逐渐减小，当回流时间达到2 min时，黄酮类的提取率达到2.5%的最大值.导致这种现象可能的原因是微波加热，溶液温度逐渐上升，引起分子摩擦增加，从而导致细胞膜破碎，有利于黄酮类化合物的溢出，提高了黄铜提取率；而随着回流时间的延长，溶液温度升高，热效应会破坏黄酮类化合物的结构，导致黄铜提取率的下降.

2.3料液比对黄酮类提取率的影响

根据不同料液比苹果皮渣的提取液在紫外可见分光光度计中测量吸光度.经过换算处理得料液比与提取率的关系图(图3).

由图3可知，随着料液比的升高，黄酮类提取率先升高，后减小，当料液比达到1∶5的时候，此时的黄铜提取率最大，继续增加溶剂的量，提取率反而下降，这可能的原因是料液比降低，溶剂吸收了较多的热，影响了黄酮类的溢出，从而导致黄酮类提取率的降低[8].

2.4微波炉功率对黄酮类提取率的影响

图4　微波功率与黄酮类提取率影响

图5　溶剂对黄酮类提取率影响

图6　Trolox-GO·标准曲线

图7　苹果皮渣黄酮类样品-GO·标准曲线

对不同微波功率加热的苹果皮渣提取液在紫外可见分光光度计中测量吸光度.经过换算处理得到提取率与微波功率的关系图(图4).

由上图可知，随着微波功率加大，提取率在增加，但超过390 W(60%)后反而会降低，这可能的原因是微波功率过大，溶液温度升高过快，随提取液可能产生的蒸发而使黄酮类化合物一起蒸发损失，从而影响黄酮类的提取率[8].

2.5溶剂浓度对黄酮类提取率的影响

相同条件下，对苹果皮渣提取液在紫外可见分光光度计中测量吸光度(图5).

由图5可知，水、乙醇作为提取剂都有较佳的提取效果，但是水没有乙醇那么好，并且不同浓度的乙醇对黄酮类的提取率也有不同的效果，当乙醇浓度为60%时黄酮类的提取率最高，因此本实验采用60%的乙醇作为溶剂.

2.6提取物抗氧化能力的测定

2.6.1Trolox-GO·标准曲线的建立

以溶于40%乙醇的Trolox溶液为标样，以吸光值的减少值与trolox浓度作标准曲线如图6，空白为0.2 mL的40%乙醇，得到清除率(y)与Trolox浓度(x)之间的回归方程: Y=-2.438x+1.278R2 =0.996，y表示反应后剩余的GO·的吸光度，x表示Trolox的浓度.

2.6.2建立苹果皮渣黄酮类浓缩液-GO·工作曲线，评价苹果皮渣黄酮类对GO·的清除能力

用10 μL微量进样器分别移取0 μL、1 μL、2 μL、3 μL、4 μL、5 μL上述苹果皮渣黄酮类浓缩液于石英比色皿中，加入2 mL乙醇和2.8 μL GO·标液，充分震荡，在25 ℃下反应10 min，用UV-7504紫外可见分光光度计上测定吸光度，绘制苹果皮渣黄酮类浓缩液-GO·工作曲线(图7).

建立回归方程为y=-0.25x+0.81，R2=0.990,y表示反应后GO·的吸光度，x表示苹果皮渣黄酮类浓度.由图表明苹果皮渣黄酮类对GO·具有清除能力；同时控制GO·浓度不变时可计算苹果皮渣黄酮类的浓度或计算给定浓度的黄酮类对GO·的清除率大小.

结果表明，苹果皮渣黄酮类对GO·的清除率随其浓度的增大而增大，最后趋于稳定，苹果皮渣最大清除率达到25.2%.

3结论

由上分析可知，所提取的黄酮类化合物具有较强的自由基清除能力，但比Trolox的弱，Trolox作为维生素E类物质的一种，也表现出良好的抗氧化性[11]，常用于药物研制.由于黄酮类化合物具有较高的营养价值和安全性，这些年来，人们越来越喜欢用天然抗氧化剂.因此，选用Trolox作为苹果皮渣黄酮类自由基清除能力测定的参照品，由此来评价苹果黄酮类的抗氧化能力.本实验的结果表明，苹果皮渣黄酮类化合物提取的最佳实验条件是：溶剂为60%的乙醇，料液比为1∶5(g/mL)，微波炉的功率为60%(390 W)，回流时间为2 min，此条件下最大吸光度为1.77%，即可得到苹果皮渣黄酮类最多.且由实验可知，苹果皮渣黄酮类对GO·的清除率随其浓度的增大而增大，即在以上最优条件下苹果皮渣黄酮类对GO·的清除率最大.

苹果皮渣黄酮类对GO·具有一定的清除能力，本实验清除能力达到25.2%，表明它对机体内的自由基有清除能力，具有较好的抗氧化能力，在药物开发方面有发展前景，但相对于标准物Trolox，其清除GO·的能力相对较弱.

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* 收稿日期：2016-03-02

DOI：10.13698/j.cnki.cn36-1037/c.2016.03.011

基金项目：江西省教育厅科学技术研究项目(GJJ13667)

作者简介：黄庆(1965-)，男，江西奉新人，赣南师范学院化学化工学院高级实验师，研究方向：酶催化、天然产物应用. † 通讯作者：张熊禄(1955-)，男，江西婺源人，赣南师范学院化学化工学院教授，研究方向：有机药物合成.

中图分类号：TQ914.1

文献标志码：A

文章编号：1004-8332(2016)03-0041-04

Study on Extraction of Flavonoids from Apple Peel with Microwave and Its Antioxidant

HUANG Qing, ZHANG Hehui, WU Xiaochen, ZHANG Xionglu

(SchoolofChemistryandChemicalEngineering,GannanNormalUniversity,Ganzhou341000,China)

Abstract:In the paper, the extraction conditions of flavonoids in apple peels were optimized based on microwave method and single factor experiment. The antioxidant abilities of flavonoids were also studied by using Trolox as the reference. The results showed that the extraction efficiency of flavonoids can reach 2.50% under the optimum extraction conditions (solid-to-liquid ratio 1:5, concertration ethanol 60%, microwave power 390 W, extraction time 2 min). The clearance rate of flavonoids extracted from apple peels toward GO· was increased as the concentration of flavonoids was increased. Moreover, the maximum clearance rate was up to 25.2 %, indicating that the flavonoids extracted from apple peels have potential clearance ability toward radicals in human bodies.

Key words:flavonoid; apple peels; microwave; galvinoxyl radical; trolox; antioxidant activity

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/36.1037.C.20160510.1106.010.html