噁二唑-2-氧化物合成及抗日本血吸虫尾蚴活性* 1

钱益平，郭同，陈祥钊，唐　勇，申昌德，许祖波，李　勋，范小林

(赣南师范学院 化学化工学院，江西 赣州　341000)



噁二唑-2-氧化物合成及抗日本血吸虫尾蚴活性* 1

钱益平†，郭同，陈祥钊，唐勇，申昌德，许祖波，李勋，范小林

(赣南师范学院 化学化工学院，江西 赣州341000)

摘要：以苯丙烯醇为原料合成噁二唑-2-氧化物，并对其进行结构表征确认，评价其抗日本血吸虫尾蚴活性.结果表明，噁二唑-2-氧化物具有不同程度的杀灭尾蚴活性，其中4-苯基-1,2,5-噁二唑-3-醛基-2-氧化物杀灭尾蚴活性最好.

关键词：噁二唑-2-氧化物；日本血吸虫；尾蚴；活性

1引言

血吸虫病是一种流行于热带和亚热带地区、严重危害人民身体健康、影响经济社会发展的重大传染病.血吸虫的种类很多，人体常见的血吸虫主要三种：日本血吸虫、曼氏血吸虫，埃及血吸虫，在我国流行的主要是日本血吸虫[1].血吸虫的生活史主要包括7个主要阶段：成虫、卵、毛蚴、母胞蚴、子胞蚴、尾蚴和童虫.尾蚴是感染人畜的唯一阶段，也是血吸虫生命周期中最脆弱阶段[1-2].因此，尾蚴的防治是控制血吸虫病传播的重要环节，杀灭了尾蚴，就消除了感染威胁.化学药物是目前杀灭尾蚴最有效手段之一，主要有吡喹酮、氯硝柳胺、硝苯柳胺和五氯酚钠等[2].

一氧化氮(NO)是一种活性氧自由基分子，具有多种生物学效用的功能分子，特别是，NO与一般的生物效应分子不同，NO无需与特异性蛋白受体结合，可借助其良好的脂溶性快速直接进入病原体体内发挥杀灭作用[3-4].近年来，发现NO对血吸虫成虫、童虫和尾蚴具有抑制和杀灭作用[5].在自然环境状态下，不存在足以导致尾蚴死亡的NO水平，但在尾蚴以外的其它寄生阶段(如中间宿主钉螺体内、终宿主哺乳动物体内)均存在能够生成NO的合成酶，能够释放NO起到防治尾蚴感染，甚至杀灭尾蚴[5].

NO是一种气体分子，难以直接作为药物使用.[6]NO供体是外源性补充NO的主要方式之一，其中噁二唑-2-氧化物是一类独特的NO供体，在较低浓度时具有很好的NO释放能力，已经被广泛应用于NO药物研究中.[6]目前尚无噁二唑-2-氧化物杀灭尾蚴活性的相关报道.因此，本文以苯丙烯醇为原料合成了一系列的噁二唑-2-氧化合物，评价了其杀灭尾蚴活性.

2实验部分

2.1仪器与试剂

主要仪器 Bruker Advance 400型核磁共振仪(瑞士Bruker公司)；SMZ 180系列体式显微镜(江西省凤凰光学集团有限公司)；DHJF-4005低温搅拌反应器(郑州长城科工贸有限公司).

主要试剂 肉桂醇、盐酸羟胺和二氧化锰购于阿拉丁试剂公司，亚硝酸钠购于天津科密欧试剂公司，其它溶剂均为分析纯.

日本血吸虫阳性钉螺购自江苏省血吸虫病防治研究所.

2.2目标化合物的合成与表征

目标化合物的合成路线见图1.以肉桂醇为起始原料，在亚硝酸钠的作用下合成化合物2，再二氧化锰氧化生成化合物3，进一步与羟胺加成生成化合物4，然后与二氯亚砜反应合成化合物5，所有的中间产物及最终产物结构都经过NMR和MS等表征确认.

图1　化合物合成路线(a)NaNO2, CH3COOH, rt; (b) MnO2, DCM, rt; (c) NH2OH·HCl, CH3COONa, EtOH, 80 ℃; (d) SOCl2, DMF, 0 ℃.

化合物2的合成[7]：称取肉桂醇6.7 g(50 mmol)于100 mL圆底烧瓶中，加入20 mL冰醋酸溶解，向反应液中缓慢滴加NaNO2(100 mmol)溶液，室温搅拌24 h，待反应完成后，用冰水淬灭，反应混合液用乙酸乙酯萃取(20 mL×3)，合并有机层，依次用饱和NaHCO3溶液、蒸馏水和饱和食盐水洗，最后往有机层加入无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残留物采用柱层析色谱分离，洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚(V/V=1∶3)，得淡黄色固体3.36 g，产率为35%.1H NMR (400MHz, CDCl3), δ (ppm): 7.80-7.82 (m, 2H), 7.53-7.55 (m, 3H), 4.72 (s, 2H), 3.20 (s, 1H).13C NMR (400 MHz, CDCl3), δ (ppm): 13C NMR (100 MHz, CDCl3), δ (ppm): 156.86, 131.38, 129.41, 127.79, 126.14, 114.90, 53.32.MS (m/z): 192 [M+H]+.

化合物3的合成[7]：称取1.5 g (7.8 mmol) 化合物2于100 mL圆底烧瓶中，加入30 mL二氯甲烷溶解，加入已活化的二氧化锰10.17 g(117 mmol)，室温搅拌反应9 h，然后过滤除去二氧化锰固体，并用二氯甲烷润洗固体残留物，滤液减压浓缩，残留物采用柱层析色谱分离，洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚(V/V=1∶5)，得淡黄色固体0.445 g，产率为30%.1H NMR (400 MHz, CDCl3), δ (ppm): 9.98 (s, 1H), 7.90-7.92 (m, 2H), 7.54-7.61 (m, 3H).13C NMR (100 MHz, CDCl3), δ (ppm): 178.22, 154.98, 131.94, 128.99, 128.72, 124.90, 113.69. MS (m/z): 190[M+H]+.

化合物4的合成[7]：称取0.2 g (1.1 mmol) 化合物3于100 mL圆底烧瓶中，加入20 mL乙醇溶解，用30 mL乙醇溶解盐酸羟胺0.115 g (1.65 mmol)和醋酸钠0.09 g (1.1 mmol)并缓慢滴入其中回流6 h，用水淬灭，反应混合液用乙酸乙酯(20 mL×3)萃取，合并有机层并用饱和食盐水洗涤有机层，最后往有机层加入无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残留物采用柱层析色谱分离，洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚(V/V=1∶3)，得淡黄色固体0.09 g，产率为40%.1H NMR (400 MHz, DMSO), δ (ppm): 12.45 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.76-7.74 (dd, 2H), 7.62-7.53 (m, 3H);13C NMR (100 MHz, CDCl3), δ (ppm): 156.40, 149.96, 135.45, 131.58, 129.29, 129.14, 111.80. MS (m/z): 205[M+H]+.

化合物5的合成[7]：称取0.08 g (0.39 mmol) 化合物4于圆底烧瓶中，加入5 mL DMF溶解，置于0 ℃下冰浴反应，缓慢滴加氯化亚砜0.12Ml (4 mmol)至反应瓶中并反应过夜，反应完毕后加入冰水淬灭，接着用二氯甲烷(20 mL×3)萃取，合并有机相，分别用饱和的碳酸氢钠，水和饱和食盐水洗涤，分出有机层，并往有机层中加入无水硫酸钠干燥，减压浓缩，残留物采用柱层析色谱分离，洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚(v/v=1∶3)，得到淡黄色固体0.0387 g，产率为54%.1H NMR (400MHz, CDCl3), δ (ppm): 7.74-7.76 (m, 2H), 7.56-7.61 (m, 3H).13C NMR (100 MHz, CDCl3), δ (ppm): 155.63 (s), 133.07, 130.20, 127.48, 124.42, 107.91. MS (m/z): 187[M+H]+.

2.3灭尾蚴活性评价

分别称取1 mmol化合物2、3、4和5，加入到1 mL DMSO中进行溶解，配制成1 mM的母液.

实验当日取阳性钉螺于锥形瓶中，加入去氯水并加以光照，室温的温度控制在25 ℃左右，保持逸蚴时间2 h.分别往24孔培养板中加入2 mL去氯水，同时分别移取1 mmol药液4 μL、8 μL、16 μL和32 μL于培养板中，稀释后的浓度分别为2 μM、4 μM、8 μM和16 μM.分别向培养板中加入血吸虫尾蚴，并设含有32 μL DMSO(最大溶解体积)的去氯水空白对照.在显微镜下观察尾蚴的存活数量.显微镜下观察凡是断尾、表皮肿胀等情况时视为死亡.

3结果与讨论

尾蚴作为血吸虫生命周期中一个重要阶段，容易受到外界刺激，对自由基也更加敏感[4-5].NO是一种自由基，具有较好的抗血吸虫尾蚴活性，但难以直接作为药物使用杀灭尾蚴.噁二唑-2-氧化物是一种已知的外源性NO供体，已经被广泛的用于外源性NO药物研究中[6].本研究合成了4个噁二唑-2-氧化物，评价了其杀尾蚴活性.实验结果发现，噁二唑-2-氧化物2-5均具有一定的杀灭尾蚴活性(表1).在同一浓度下(4μM)，化合物3作用1h后杀灭尾蚴活性为5.9%，2h后导致尾蚴死亡率可明显提高到58.8%，相比1h活性提高了近10倍，4h后可完全杀灭尾蚴(100%)(表1和图2).表明，化合物3随作用时间的延长，其杀灭活性显著提高.这种活性-时间效应现象，在化合物2、4和5杀尾蚴活性中也有不同程度的体现.由此说明，噁二唑-2-氧化物对尾蚴致死率随作用时间的递增呈现递增趋势，具有一定的时间效应.

表1　噁二唑-2-氧化物灭日本血吸虫尾蚴活性

注：显微镜下观察药物灭蚴活性.凡是断尾、表皮肿胀以及解剖针刺激无反应视为死亡.

进一步分析发现，化合物灭尾蚴活性随浓度的增加均不同程度上升，但相对提高的不是很明显.作用浓度为2 μM时，化合物2、3、4和5作用尾蚴4 h后，尾蚴死亡率分别达到12%、100%、23.1%和25%(图3)，进一步提高作用浓度到8 μM时，尾蚴死亡率分别达到10%、100%、33.3%和41.2%(图3)，并没有显著的提高.实际上，化合物浓度的提高，实质是NO浓度的提高.该实验结果提示，外源性噁二唑-2-氧化物对尾蚴具有杀灭作用，但杀灭活性与使用剂量无明显的相关性，即可能NO浓度不是影响活性的主要因素.这与外源性NO供体对成虫的杀灭效果不一致[8].

图2　化合物3在4 μM时灭尾蚴效果

此外，从化合物杀灭尾蚴整体效果分析可知，在作用剂量4 μM下，作用时间2 h时，化合物2、4和5作用尾蚴的致死率均未超过30%，但化合物3杀灭尾蚴活性可达到58.8%，进一步延长作用时间，化合物2、4和5的致死率虽有所提高，但仍均未超过50%，明显低于化合物3，而化合物3 在作用4 h可完全杀灭尾蚴(图4).同样，在其它作用浓度和时间下，3对尾蚴的杀灭效果同样明显好于化合物2、4和5(表1).进一步分析可知，噁二唑-2-氧化物灭尾蚴效果为3>5>4>2.

NO作为杀灭病原体的一种小分子，具体的作用机理尚未完全阐明.一般认为是NO的细胞毒性，如NO能与病原体中某些物质反应生成更强的氧化物质，如生成超氧阴离子自由基、过氧亚硝基负离子等，导致体内过氧化级联反应大量发生，从而造成病原体损伤[9]；此外NO还可引起病原体脂质、蛋白质和核酸等亚硝基或硝化，从而使病原体体膜破坏、防御体系失活和DNA断裂等，进一步引起病原体损伤和死亡[10].化合物3灭尾蚴的药效最强，这可能是由于C-3位醛基高的亲电性，容易与维持尾蚴体表糖腭上的蛋白质等物质反应，快速破坏了尾蚴体表糖萼结构，导致其不能适应外界环境，从而导致其快速死亡，具体的原因正在进一步研究中.

图3　化合物2-5在不同浓度下4 h灭尾蚴效果　　　　　图4化合物2-5(4 μM)在不同时间下灭尾蚴效果

4结论

本文合成了4种噁二唑-2-氧化物，并进行了核磁、质谱表征确认为目标结构，评价了其灭日本血吸虫尾蚴活性.实验结果表明，外源性NO供体噁二唑-2-氧化物对日本血吸虫尾蚴具有较明显的杀灭效果，其中4-苯基-1,2,5-噁二唑-3-醛基-2-氧化物(3)灭尾蚴活性最好.

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* 收稿日期：2016-04-05

DOI：10.13698/j.cnki.cn36-1037/c.2016.03.009

基金项目：国家自然科学基金项目(21302022)

作者简介：郭同(1990-)，男，赣南师范学院化学化工学院2013级硕士研究生，研究方向：血吸虫防治药物. † 通讯作者：钱益平(1984-)，男，赣南师范学院化学化工学院讲师、博士，研究方向：有机药物化学.

中图分类号：O626.27

文献标志码：A

文章编号：1004-8332(2016)03-0033-04

Synthesis of Oxadiazole-2-Dxide Analogues as Anti-SchistosomaJaponicumCercaria Agents

QIAN Yiping, GUO Tong, CHEN Xiangzhao,TANG Yong, SHEN Changde, XU Zhubo, LI Xun, FAN Xiaolin

(SchoolofChemistryandChemicalEngineering,GannanNormalUniversity,Ganzhou341000,China)

Abstract:A series of oxadiazoles-2-oxide analogues were synthesized by benzene propylene glycol as raw material, and their structures were confirmed by1H NMR and EI-MS, and their anti-schistosoma japonicum cercaria activities were evaluated. The results showed that the drugs had obvious the activity against schistosoma japonicum cercaria. Among them, the compound 4-phenyl-1,2,5-oxadiazoles-3-aldehyde-2-oxide had a best effect on anti-schistosoma japonicum cercaria.

Key words:oxadiazoles-2-oxides; schistosoma japonicum; cercaria; activity

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/36.1037.C.20160510.1213.028.html