HPLC法测定大鼠血浆和脑组织中的埃克替尼浓度

杨梅

(中国医学科学院 北京协和医学院肿瘤医院 药剂科，北京 100021)

HPLC法测定大鼠血浆和脑组织中的埃克替尼浓度

杨梅Δ

(中国医学科学院 北京协和医学院肿瘤医院 药剂科，北京 100021)

目的 建立大鼠血浆和脑组织中埃克替尼浓度的HPLC测定方法。方法 将55只大鼠随机分为11组，每个采样时间点的动物数为5。给药前12 h禁食，口服灌胃给予埃克替尼70 mg/kg。于给药前和给药后0.5、1、2、3、4、6、8、12、24和48 h，分别采集大鼠静脉血及脑组织，样品经蛋白沉淀法处理后，采用Waters XTerra RP C18(2.1 mm×150 mm，5 μm)色谱柱；在流动相为水-乙腈(25:75)，流速为0.12 mL/min，334 nm波长处，保持柱温25 ℃的条件下进样20 μL检测。结果 内源性杂质不干扰测定，埃克替尼在0.05～25 μg/mL范围内具有良好的线性关系Y=0.793X+0.101，r=0.9986(血浆)和Y=0.84X+0.0818，r=0.9965(组织)，最低检测限为0.05 μg/mL。低、中、高3个浓度的方法回收率和提取回收率分别为98.1%、102.1%、101.5%和64.3%、69.5%、75.8%，RSD%(n=5)分别为7.3、9.2、6.6和3.5、2.3、2.1。日内、日间精密度(RSD%，n=5)分别为7.14、5.82、3.79和8.08、6.24、4.43，均小于10%。给药前和给药后0.5、1、2、3、4、6、8、12和24 h、48 h大鼠血浆和脑组织中埃克替尼浓度分别为0、(0.25±0.04)、(2.77±0.23)、(2.54±0.61)、(2.89±0.72)、(3.94±0.77)、(6.45±1.60)、(0.33±0.09)、(0.56±0.11)、(0.45±0.03)、(0.43±0.03)μg/mL和0、(0.20±0.07)、(0.14±0.06)、(0.11±0.01)、(0.15±0.08)、(0.11±0.03)、(0.13±0.04)、(0.07±0.01)、(0.08±0.02)、(0.06±0.02)、(0.05±0.01)μg/mL。结论 本方法简便、快速、灵敏、准确、专属性强、重现性好。

埃克替尼；HPLC；血浆；脑组织

埃克替尼是我国自主研制成功，第一个拥有自主知识产权的表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂，于2011年6月经SFDA批准上市，用于晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的治疗[1-2]。对该药物的研究也正随着其广泛应用而不断深入[3-6]。研究药物在体内的代谢情况，可以更好的为临床用药服务。目前对于埃克替尼能否透过血脑屏障进入脑组织的研究较少，本研究旨在建立一种简便、快速、灵敏、准确、专属性强、重现性好的HPLC方法，可用于大鼠体内埃克替尼的药动学分析，并为临床研究奠定基础。

图1 埃克替尼结构式Fig.1 The structure of icotinib

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物： 55只SD大鼠，SPF级，雄性，体质量(200±20)g；北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK(京)2012-0001。

1.1.2 药品与试剂：盐酸埃克替尼对照品(纯度98%，浙江贝达药业有限公司，批号20130902)；内标舒尼替尼(纯度>99%，辉瑞制药有限公司，批号U684A)。乙腈、甲醇为Fisher公司产品(色谱级)；Millipore去离子水；其余试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器：Waters高效液相色谱系统，包括：515泵，717自动进样器，柱温箱，温度控制器，2487紫外检测器，Epower色谱工作站；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)；Allegra 21R低温离心机(美国Beckman Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件：色谱柱：Waters XTerra RP C18(2.1 mm×150 mm，5 μm)；流动相：水：乙腈(25:75)；流速：0.12 mL/min；进样量：20 μL；检测波长：334 nm；柱温：25 ℃。在上述色谱条件下，进样埃克替尼及内标。

1.2.2 埃克替尼与内标储备液的配制：精密称取埃克替尼对照品30.0 mg于50 mL量瓶中，用去离子水(pH6.8)溶解并稀释至刻度，得浓度为600.0 μg/mL埃克替尼储备液，于冰箱4 ℃保存；精密称取舒尼替尼12.5 mg于50 mL量瓶中，用去离子水(pH6.8)溶解并稀释至刻度，得浓度为250.0 μg/mL内标储备液，于冰箱4 ℃保存。临用时稀释成25 μg/mL的内标溶液。

1.2.3 血浆样品和组织：取血浆样品或匀浆后的组织样品100 μL，加25 μg/mL的内标溶液150 μL，混匀，加甲醇-乙腈(1:9)3mL，涡旋1 min后放置5 min，于3500 r/min离心10 min，取上清液于60 ℃水浴放置，氮气吹干，残渣用1.5 mL流动相溶解，离心(r=10cm，15000 rpm，10 min)，取上清液，进样20 μL。

1.2.4 线性关系：分别配制0.05、0.1、0.5、2.5、5、10、25 μg/mL的埃克替尼对照品血浆或组织样品，进样20 μL检测，以埃克替尼和内标物的峰面积比值为纵坐标，埃克替尼的浓度为横坐标，进行线性回归。

1.2.5 回收率、准确度和精密度的考察：分别配制埃克替尼浓度为低、中、高(0.5、5、25 μg/mL)的样品各5份，按样品处理方法操作后测定，计算方法回收率。另用流动相配制相应系列的埃克替尼溶液，不经提取直接测定，以此为标准，将2组峰面积相比，计算埃克替尼的提取回收率。同法配制埃克替尼浓度为低、中、高(0.5、5、25 μg/mL)的样品各5份，同日处理进行测定，计算日内相对标准差。以后取低、中、高(0.5、5、25 μg/mL)的样品各1份，连续测定5d。

作为战略性新兴产业，传统商贸企业应用电子商务对区域经济发展至关重要。近年来，全市虽然安排了一定的财政资金用于扶持电子商务产业发展，但与杭州、深圳等发达地区设立专项资金支持传统商贸企业应用电子商务相比，全市对电商的扶持力度还不够大，政府对传统商贸企业线上线下发展的引导作用没有充分发挥。

1.2.6 稳定性考察

① 储备液的稳定性考察 取埃克替尼和内标储备液，分别在1、10、25、45、60 d用流动相配制成60和25 μg/mL的溶液直接进样20 μL，记录峰面积。

② 埃克替尼加内标血浆的稳定性考察 按“1.2.3”项下方法分别配制低、中、高3种浓度(0.5、5、25 μg/mL)的血浆样品各5份，分别在短期(0、6、12、18、24 h)，长期(-20 ℃冻存1、5、10、20、30d)和冻融(1、2、3、4、5次)条件下进行色谱测定，记录埃克替尼和内标的峰面积。

1.3 大鼠体内药物浓度测定

1.3.1 分组及给药方法：分组：按照采样时间点即给药前和给药后0.5、1、2、3、4、8、12、24和48 h，将55只大鼠随机分为11组，每个采样时间点的动物数为5。

给药方法：精密称取埃克替尼对照品200.0 mg于100 mL量瓶中，用去离子水(pH6.8)溶解并稀释至刻度，得浓度为2 mg/mL埃克替尼溶液。大鼠在给药前12 h禁食，按照70 mg/kg的剂量口服灌胃给予埃克替尼。

1.3.2 标本提取及处理：标本提取：于给药前和给药后0.5、1、2、3、4、8、12、24和48 h，将大鼠抓取固定后，使其颈部充分暴露，剪开颈部皮肤、肌肉，充分暴露血管，自颈静脉取血5 mL；然后将大鼠断头，剪开颅骨，取脑组织1 g，标本放置于-20 ℃冰箱冻存待测。

标本处理：血液于3000 rpm/min离心10 min后取血浆。每份组织标本加入乙酸铵缓冲液2 mL，使用研钵充分研磨后，3000 r/min离心10 min后提取上清液，-20 ℃冰箱冻存。

2 结果

图2 空白样本、血浆和脑组织样本及内标的HPLC图谱1：埃克替尼；2：舒尼替尼Fig.2 HPLC chromatogram of negative samples, plasma and brain tissue samples, sunitinib1：icotinib; 2：sunitinib

2.2 线性关系 埃克替尼血浆样品标准曲线的回归方程为Y=0.793X+0.101，r=0.9986，组织样品标准曲线的回归方程Y=0.84X+0.0818，r=0.9965。显示标准曲线在0.05～25 μg/mL范围内具有良好的线性关系。

2.3 回收率，准确度和精密度考察 按“1.2.5”项下方法计算方法回收率，提取回收率和日内、日间相对标准差。结果显示，埃克替尼的方法回收率均>90%，日内、日间相对标准差均<10%。见表1。

表1 回收率和日内、日间精密度(n=5)

2.4 稳定性考察

2.4.1 储备液的稳定性考察：埃克替尼和内标的峰面积的RSD均<5%，表明埃克替尼和内标储备液至少在60 d内稳定。

2.4.2 埃克替尼加内标血浆的稳定性考察：埃克替尼和内标的稳定性结果见表2。短期、长期及冻融条件下2者峰面积的RSD均<10%。

表2 埃克替尼和内标的稳定性(n=5)

2.5 大鼠血浆和脑组织中的药物浓度测定结果 大鼠灌胃给药后，测定给药前和给药后0.5、1、2、3、4、8、12、24和48 h血浆及脑组织中的药物浓度，结果见表3。

表3 埃克替尼在大鼠血浆和脑组织中的药物浓度±s，n=5)

3 讨论

埃克替尼上市后，随着研究的不断深入，其在血浆和多种组织中的药动学研究已有报道[7-8]。但药物能否透过血脑屏障分布至脑组织，目前尚未见报道。因此本研究建立的埃克替尼在脑组织中的HPLC测定方法，为进一步研究药物在脑组织中的药动学特征及进行临床研究奠定基础。

药物即使可透过血脑屏障进入脑组织，其含量也会相对较低，只有借助高灵敏度和高分辨力的测定方法才能满足临床和科研实验的检测要求。因此在探索该检测方法时，基于既往研究的基础上[9-10]，本研究建立的测定方法，药物浓度在0.05～25 μg/mL之间具有良好的线性关系。回收率，批内、批间差异及稳定性均符合检测要求。因此该方法灵敏、准确且简便。

通过实验发现，若柱平衡时间较短，连续进样时对保留时间有所影响，因此柱平衡很重要。测定药物在脑组织的含量时，为了将更多的药物游离出来，蛋白质的去除是很关键的。本研究采用甲醇-乙腈沉淀蛋白法，简单快捷，沉淀完全，色谱峰峰形良好，且获得了较高的回收率，准确度和精密度考察结果。流动相的选择参考相关文献[10-11]，采用醋酸铵与乙腈或甲醇的不同配比进行分离，但均未达到完全分离。经反复实验，采用本文所选的流动相配比分离效果最佳，样品与内标在10 min内便可完全分离，且不受内源性杂峰的干扰。

本实验建立了埃克替尼在血浆和脑组织中的HPLC检测方法，本方法简便、快速、灵敏、准确、专属性强、重现性好。

通过本实验建立的方法测定了药物在大鼠血浆和脑组织中的浓度，表明药物可部分透过血脑屏障进入脑组织，为药物的临床合理应用提供了实验依据。

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(编校：王冬梅)

Determination of icotinib in rat plasma and brain tissue by HPLC

YANG MeiΔ

(Department of Pharmacy, Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Mdeical College, Beijing 100021, China)

ObjectiveTo establish a HPLC method for the determination of icotinib in rat plasma and brain tissue.MethodsFifty-five rats were randomly divided into 11 groups, each group was five rats. Administration of 12 h before fasting, oral intragastric administration of icotinib 70 mg/kg. The plasma and brain tissue samples were pretreated by protein precipitation,and the separation was performed on a Waters X Terra RP C18column (2.1 mm×150 mm，5 μm)before and after administration 0.5, 1, 2, 3, 4, 8, 12, 24, 48 h.The mobile phase consisted of water-acetonitrile(25:75), at a flow rate of 0.12 mL/min.Detection was carried out at the wave length of 334 nm and the column temperature of 25 ℃.The sample size was 20 μL.ResultsThe linear range of calibration curve was 0.05-25 μg/mL, the lowest limit of detection was 0.05 μg/mL,Y=0.793X+0.101 andr=0.9986(plasma),Y=0.84X+0.0818 andr=0.9965(tissue). The method recoveries and extraction recoveries of three concentrations were respectively 98.1%, 102.1%, 101.5% and 64.3%, 69.5%, 75.8%; RSD%(n=5)were respectively 7.3, 9.2, 6.6 and 3.5, 2.3, 2.1. The intra- and inter- day precisions(RSD%,n=5) were respectively 7.14, 5.82, 3.79 and 8.08, 6.24, 4.43, less than 10%. Administration of before and after 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 24, 48 h, icotinib concentrations of plasma and brain tissue in rats were respectively 0, 0.25±0.04, 2.77±0.23, 2.54±0.61, 2.89±0.72, 3.94±0.77, 6.45±1.60, 0.33±0.09, 0.56±0.11, 0.45±0.03, 0.43±0.03 μg/mL and 0, 0.20±0.07, 0.14±0.06, 0.11±0.01, 0.15±0.08, 0.11±0.03, 0.13±0.04, 0.07±0.01, 0.08±0.02, 0.06±0.02, 0.05±0.01 μg/mL.ConclusionThe HPLC method is simple, rapid, sensitive, accurate, highly specific and reproductive.

icotinib; HPLC; plasma; brain tissue

中国医学科学院肿瘤医院临床课题(LC2011B39)

杨梅，通信作者，女，硕士，主管药师，研究方向：医院药学，临床药学，E-mail：yangmei910@163.com。

R927.2;O657.72

A

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.03.55