miR-21对氧化应激诱导的心肌细胞损伤的影响

张亚琴

(河南省郑州市中心医院大内科　450000)



miR-21对氧化应激诱导的心肌细胞损伤的影响

张亚琴

(河南省郑州市中心医院大内科450000)

[摘要]目的探讨miR-21对过氧化氢(H2O2)诱导的H9c2心肌细胞损伤的影响。方法体外培养H9c2心肌细胞，实验分为4组，空白对照组、阴性对照组(miR-21 mimics NC)、H2O2组、H2O2+miR-21 mimics组；采用MTT法及AnnexinV-PI流式双染法检测各组细胞活力和凋亡情况；DCFH-DA探针负载方法检测各组细胞内活性氧(ROS)水平；分光光度法检测各组丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)水平；蛋白免疫印迹法(Western blot)检测程序性细胞死亡因子4(PDCD4)、Bax、Bcl-2及人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因蛋白(PTEN)/蛋白激酶(AKT)信号通路激活情况。结果与空白对照组及阴性对照组比较，H2O2组中细胞活力下降(P<0.01)，ROS荧光强度及MDA水平增加(P<0.01)，SOD水平下降(P<0.01)，细胞凋亡率上升(P<0.01)，Bcl-2表达及AKT磷酸水平下调(P<0.01)，Bax、PDCD4及PTEN表达上调(P<0.01)。与H2O2组比较，H2O2+miR-21 mimics组中细胞活力提高(P<0.01)，ROS荧光强度及MDA水平降低(P<0.01)，SOD水平提高(P<0.01)，细胞凋亡率降低(P<0.01)，Bcl-2表达及AKT磷酸水平上调(P<0.01)，Bax、PDCD4及PTEN表达下调(P<0.01)。结论miR-21过表达能显著抑制H9c2心肌细胞氧化应激损伤，与清除细胞内氧化应激产物及抵抗细胞凋亡有关，可能是通过PTEN/AKT信号通路实现的。

[关键词]miR-21；H9c2心肌细胞；氧化应激；凋亡

心肌细胞氧化应激及其导致的凋亡是心肌梗死、心力衰竭、高血压、动脉粥样硬化、冠心病等心血管疾病的重要机制，通过阻断心肌细胞氧化应激损伤，从而减轻心肌细胞凋亡对于心血管疾病的治疗具有一定的应用价值[1]。以往对miRNA的关注主要集中于肿瘤形成中，近些年来miRNA在心血管疾病中的作用逐渐进入公众视野，已有数十种miRNA在心肌细胞中特异性表达，如miR-1、miR-29、miR-21、miR-126、miR-133、miR-199、miR-24等，并参与了心力衰竭、心律失常、心脏肥大、心脏缺血/再灌注等病理过程[2-3]。miR-21不仅在众多组织器官包括心脏、小肠、脑、乳腺及胰腺上表达，在心肌细胞，血管平滑肌细胞，血管内皮细胞，等心血管细胞类型中皆有表达，并在心肌梗死、心力衰竭、心脏肥大等过程中差异性表达[4-5]。已证实过氧化氢(H2O2)刺激乳鼠心肌细胞后导致miR-21表达量上调，且miR-21类似物能抑制H2O2诱导的乳鼠心肌细胞凋亡[6]，但具体机制未知。因此，本研究在此基础上，通过H2O2刺激H9c2心肌细胞产生氧化应激及细胞凋亡，并加入miR-21类似物进行干预，从而探讨miR-21对H9c2心肌细胞氧化应激及细胞凋亡的影响及具体机制。

1材料与方法

1.1材料大鼠心肌细胞H9c2购于中国科学院上海细胞库(目录号：GNR5)，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。DCFH-DA探针购自碧云天生物技术研究所；超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；胎牛血清、DMEM培养基、四甲基偶氮唑盐(MTT)购自美国Gibco公司。miR-21 mimics及miR-21 mimics NC由广州市锐博生物科技有限公司订购合成。迷你双垂直电泳仪，迷你转印电泳仪购自北京六一仪器厂；FACSCanto流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2方法

1.2.1细胞转染及分组采用适量无血清Opti-MEM®Ⅰ培养基分别稀释稀释miRNAs及 Lipofectamine 2000。将稀释的Lipofectamine 2000和稀释的miRNAs混合，室温孵育20～30 min；将miRNAs/Lipofectamine 2000复合物加入96或6孔板，6 h后换成含10%血清的DMEM培养基，37 ℃，CO2培养箱培养24～72 h，荧光显微镜下检测转染效率并RT-PCR法验证转染情况。miR-21 mimics及miR-21 NC转染浓度分别为200 nm和200 nm。将实验分为4组，空白对照组，阴性对照组(miR-21 mimics NC)，H2O2组，H2O2+miR-21 mimics组。

1.2.2RT-PCR检测OA软骨细胞中Sirt1的表达按1.2.1进行操作后，参考Trizol试剂盒 (Invitrogen) 使用说明书提取总RNA。引物如下，miR-21上游引物：5′-GCC GCT AGC TTA TCA GAC TGA TGT-3′，下游引物：5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′；GAPDH上游引物：5′-AGC CAC ATC GCT CAG ACA-3′，下游引物：5′-TCT CCT GGG AGG CAT AGA CC-3′。通过一步法RT-PCR试剂盒将RNA逆转录成cDNA并进行PCR扩增，获取5 μL扩增产物用于下一步2%的琼脂糖胶进行检测并拍照。

1.2.3细胞活力检测采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法按1.2.1分组方法进行给药，继续培养24 h，每孔加MTT(5 mg/mL)20 μL，4 h后，弃上清液，并每孔加入DMSO 150 μL，10 min后，酶标仪570 nm处测定吸光度(A)值。

1.2.4细胞内ROS水平测定按照1.2.1处理细胞后，继续培养48 h，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，后加入含有20 μmol/L DCFH-DA 的PBS，37 ℃孵育2 h，后荧光显微镜下进行检测。荧光强度与细胞内ROS水平呈正相关，由此可反映细胞内ROS水平。

1.2.5细胞内MDA、SOD水平按照1.2.1处理细胞后，培养48 h，后离心收集细胞，反复冻融，使细胞内容物流出，取上清液检测MDA及SOD水平，按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.6Annexin V-PI流式双染按照1.2.1处理细胞后，继续培养48 h，避光染色30 min上机检测。按照Annexin V-FITC/ PI细胞凋亡检测试剂盒说明书的方法，用0.25%的胰蛋白酶消化，PBS洗涤，2 000 r/min离心5 min，收集细胞；按顺序分别加入500 μL Binding Buffer，5 μL Annexin V-FITC及5 μL PI 5，混匀，于室温避光反应10 min，在1 h内进行流式细胞仪检测。

1.2.7蛋白免疫印迹法(Western blot)检测按照1.2.1处理细胞后，继续培养48 h，收集细胞样本，加入裂解液裂解，离心，获得蛋白样品。用BCA试剂盒检测蛋白浓度。蛋白上样，进行十二烷基-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜，封闭，加入一抗4 ℃孵育过夜。次日加二抗孵育后曝光。用Quantity one软件对蛋白灰度值进行分析。

2结果

2.1各组细胞中miR-21 mimics转染及miR-21表达情况经荧光显微镜观察拍照，并计算荧光强度，发现转染效率高达80%以上，说明转染成功。经miR-21 mimic转染后，细胞中miR-21表达量上调，见图1。

A：空白对照组；B：阴性对照组；C：H2O2组；D：H2O2+miR-21 mimics组；a：P<0.01，与空白对照组及阴性对照组比较；b：P<0.01，与H2O2组比较。

图1各组细胞中miR-21表达情况

2.2各组细胞活力的测定与空白对照组(92.79±3.85)%及阴性对照组(90.03±1.24)%比较，H2O2组细胞活力(48.21±2.66)%显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)；与H2O2组比较，H2O2+miR-21 mimics组中细胞活力(80.77±4.32)%显著提高，差异有统计学意义(P<0.01)，见图2。

A：空白对照组；B：阴性对照组；C：H2O2组；D：H2O2+miR-21 mimics组；a：P<0.01，与空白对照组及阴性对照组比较；b：P<0.01，与H2O2组比较。

图2各组细胞活力的测定

2.3各组细胞中ROS荧光强度的测定与空白对照组及阴性对照组比较，H2O2组中ROS荧光强度上升，差异有统计学意义(P<0.01)；与H2O2组比较，H2O2+miR-21 mimics组中ROS中荧光强度降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见图3。

2.4各组细胞中MDA和SOD水平的测定与空白对照组及阴性对照组比较，H2O2组中MDA水平上升，SOD水平显著下降，差异均有统计学意义(P<0.01)；与H2O2组比较，H2O2+miR-21 mimics组中MDA水平降低，SOD水平上升，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表1。

2.5各组细胞凋亡的测定与空白对照组及阴性对照组比较，H2O2组中心肌细胞凋亡率显著上升，差异有统计学意义(P<0.01)；与H2O2组比较，H2O2+miR-21 mimics组中细胞凋亡率下降，差异有统计学意义(P<0.01)，见图4。

A：空白对照组；B：阴性对照组；C：H2O2组；D：H2O2+miR-21 mimics组；a：P<0.01，与空白对照组及阴性对照组比较；b：P<0.01，与H2O2组比较。

图3　各组细胞中ROS荧光强度的测定

a：P<0.01，与空白对照组及阴性对照组比较；b：P<0.01，与H2O2组比较。

A：空白对照组；B：阴性对照组；C：H2O2组；D：H2O2+miR-21 mimics组。

图4各组细胞凋亡的测定

2.6各组细胞中凋亡相关蛋白的测定与空白对照组及阴性对照组比较，H2O2组中Bcl-2表达下调，Bax及PDCD4表达上调，差异均有统计学意义(P<0.01)；与H2O2组比较，H2O2+miR-21 mimics组中Bcl-2表达上调，Bax及PDCD4表达下调，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表2，图5。

2.7各组细胞中PTEN/AKT激活情况与空白对照组及阴性对照组比较，H2O2组中PTEN表达上调，AKT磷酸化水平降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；与H2O2组比较，H2O2+miR-21 mimics组中PTEN表达下调，AKT磷酸化水平提高，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表3，图6。

图5　各组细胞中凋亡相关蛋白的测定

组别Bax/GADPHBcl-2/GADPHPDCD4/GADPH空白对照组0.124±0.0231.005±0.0740.432±0.037阴性对照组0.129±0.0251.002±0.0980.433±0.042H2O2组1.035±0.096a0.100±0.009a1.205±0.114aH2O2+miR-21mimics组0.120±0.011b0.935±0.094b0.458±0.046b

a：P<0.01，与空白对照组及阴性对照组比较；b：P<0.01，与H2O2组比较。

图6　各组细胞中PTEN/AKT激活情况

组别PTEN/GADPHp-AKT/AKT空白对照组0.198±0.0141.215±0.100阴性对照组0.189±0.0131.212±0.894H2O2组0.521±0.043a0.463±0.042aH2O2+miR-21mimics组0.223±0.020b0.998±0.096b

a：P<0.01，与空白对照组及阴性对照组比较；b：P<0.01，与H2O2组比较。

3讨论

miR-21是2001年有学者在非脊椎动物和脊椎动物中发现的，随后在小鼠的神经元细胞及Hela细胞中陆续检测到，miR-21基因定位于17号染色体，全长22 nt，是一种高度保守的内源性小分子RNA，它能够结合于靶基因mRNA的3′-UTR区域，阻遏靶基因的翻译，从而抑制靶基因表达，并在多种人类肿瘤细胞中呈过表达[7]。近些年研究发现，miR-21参与心肌梗死、心力衰竭、心律不齐、心脏肥大等心血管疾病的生理病理过程[4-5]。Cheng等[6]发现，H2O2刺激乳鼠心肌细胞会导致miR-21的表达上调，而miR-21类似物的转染能减轻H2O2诱导的乳鼠心肌细胞的凋亡，当抑制miR-21表达后，抗凋亡效应消失。随后Cheng等[8]的研究进一步发现在大鼠心脏缺血预适应24 h后，给予左前降支结扎再灌注，从而导致miR-21表达量的升高，当敲除此时心肌细胞中miR-21的表达，会使缺血预适应的保护效应消失。Sayed等[9]也发现miR-21能抵抗低氧诱导的心肌细胞凋亡，缩小梗死面积和缓解心衰。从而说明miR-21对各种应激条件下的心肌细胞的保护作用。因而本研究在此基础上探讨miR-21对氧化应激导致的心肌细胞凋亡的影响。

H2O2作为氧化应激模型的常用诱导剂，本研究也采用H2O2来诱导H9c2心肌细胞氧化应激损伤模型，预实验浓度200 μmol/L与Wang等[10]，钟源等[11]用于诱导心肌细胞氧化应激模型的作用浓度一样，因而作为本研究的H2O2诱导浓度。研究结果显示，H2O2诱导后，心肌细胞中ROS荧光强度及MDA水平显著提高，SOD水平降低。而miR-21表达量提高后，能提高H2O2诱导的H9c2细胞中SOD水平，降低ROS荧光强度及MDA水平，从而提示miR-21能通过清除细胞内氧化应激产物抵抗H2O2诱导的H9c2细胞氧化应激损伤。

心力衰竭、心肌缺血、心肌梗死、心脏重塑、缺血再灌注损伤等心血管疾病不仅能造成心肌细胞膜脂质过氧化，又使DNA断裂，线粒体受损，最终导致心肌细胞凋亡及坏死，进一步加重疾病的发展，导致恶性循环[12-13]。因此，减少心肌细胞凋亡对心血管疾病的治疗亦具有重要意义。MTT法及AnnexinV-PI流式双染结果表明H2O2模型组中心肌细胞活力降低，细胞凋亡率升高，当miR-21表达量提高后，能显著抑制H2O2诱导的H9c2心肌细胞凋亡，与Cheng等[6,8]的观点一致。提示miR-21能通过抑制细胞凋亡从而抵抗H2O2诱导的H9c2细胞氧化应激损伤。并且在H2O2诱导的H9c2心肌细胞凋亡程度提高的同时常伴随着Bcl-2表达量的下降，Bax、PDCD4表达量的上升[14]。研究已证实PDCD4、Bcl-2是miR-21的靶蛋白，Dong等[15]研究证实急性心肌梗死24 h后，心脏过表达miR-21能显著缩小心肌梗死面积，是通过靶向下调PDCD4的表达实现的。本研究结果表明miR-21表达量提高后，能显著提高H2O2诱导的H9c2心肌细胞中Bcl-2表达量，降低PDCD4及Bax表达量。细胞的增殖与凋亡受众多信号通路调控，PI3K/AKT信号通路就是其中一种，其具有抗凋亡通路之称，能通过下游多种靶蛋白表达，从而参与调控细胞生长、凋亡、血管生成等过程。PI3K/AKT上游蛋白PTEN是miR-21的下游靶基因。PTEN能将三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)去磷酸化为二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)，从而负调控PI3K/AKT信号通路，在细胞凋亡中起重要作用。所以笔者进一步探讨造模并转染后，心肌细胞中PTEN/AKT信号通路的激活情况，结果表明miR-21 mimics能显著的下调PTEN表达，上调AKT磷酸化水平。

综上所述，通过瞬时转染miR-21 mimics，能显著的抑制H2O2诱导的H9c2心肌细胞氧化应激水平及细胞凋亡程度，与降低ROS荧光强度及MDA水平，提高SOD水平，上调Bcl-2表达，下调PDCD4及Bax表达有关，可能是通过PTEN/AKT信号通路实现的。

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作者简介：张亚琴(1968-),副主任医师，本科,主要从事心内科工作。

doi:·经验交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.16.033

[中图分类号]R542.2

[文献标识码]B

[文章编号]1671-8348(2016)16-2257-04

(收稿日期：2015-12-21修回日期：2016-03-12)