siRNA沉默凋亡抑制蛋白基因对支气管哮喘小鼠气道平滑肌增殖的影响

王　涛,韩　娜

(河北大学附属医院(北院)肺二科,河北保定 071000)



siRNA沉默凋亡抑制蛋白基因对支气管哮喘小鼠气道平滑肌增殖的影响

王涛,韩娜△

(河北大学附属医院(北院)肺二科,河北保定 071000)

[摘要]目的探讨siRNA沉默凋亡抑制蛋白基因对支气管哮喘小鼠气道平滑肌增殖的影响。方法将20只雌性BALB/c小鼠分为实验组和对照组，实验组构建哮喘模型，取气管和支气管进行细胞培养。对实验组和对照组培养的气道壁平滑肌细胞分别进行分组：磷酸盐缓冲液(PBS)对照组(加入PBS)、错义链对照组(转染错义链)和siRNA转染组(转染siRNA Survivin)，检测气道壁平滑肌细胞中Survivin基因、Survivin蛋白和caspase-9蛋白表达，检测细胞上清液中IL-6和人趋化因子(CCL5)水平。结果RT-PCR结果显示，实验组中siRNA转染组小鼠气道壁平滑肌细胞中Survivin RNA相对表达量均低于PBS对照组和错义链对照组，气道壁平滑肌细胞中 Survivin蛋白表达量均低于PBS对照组和错义链对照组，而caspase-9蛋白表达量则高于PBS对照组和错义链对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；实验组中siRNA转染组气道壁平滑肌细胞合成分泌IL-6和CCL5水平均低于PBS对照组和错义链对照组；2～4 d细胞增殖量均低于PBS对照组和错义链对照组；气道壁平滑肌细胞G0/G1期比例高于PBS对照组和错义链对照组，而S/G2期比例则低于PBS对照组和错义链对照组，细胞凋亡率则高于PBS对照组和错义链对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论siRNA特异性沉默Survivin基因，可加速气道壁平滑肌细胞凋亡，有效抑制细胞异常增殖及分泌功能。

[关键词]支气管哮喘；Survivin；气道平滑肌细胞；增殖

支气管哮喘是呼吸科常见的气道慢性炎症性疾病，病理过程复杂，研究认为[1]，气道慢性炎症诱发气道重塑是其发病的重要病理基础。气道重塑过程主要涉及慢性炎症所致气道壁平滑肌细胞大量增殖和细胞外基质沉积，其中，平滑肌细胞大量增殖在气道重塑中尤为重要[2]，如何有效抑制平滑肌细胞增殖及表型转化，有望为支气管哮喘治疗提供新的契机。存活蛋白(Survivin)是凋亡抑制蛋白家族中抑制凋亡作用最强的蛋白，可通过抑制caspase激活而对细胞凋亡起负向调控，在细胞异常增殖及恶性转化中发挥重要作用[3]。已有研究表明[4]，Survivin参与并调控肿瘤细胞异常增殖、凋亡过程。但其在气道平滑肌细胞增殖中的作用鲜有报道。本研究尝试采用小干扰RNA(siRNA)靶向沉默Survivin基因，通过改变Survivin基因表达观察其对气道平滑肌细胞生物学行为的影响，以期为支气管哮喘基因靶向治疗提供基础资料。

1材料与方法

1.1材料标准胎牛血清和鼠抗平滑肌α肌动蛋白单克隆抗体均购自购自美国Sigma公司，胰蛋白酶液、DMEM高糖培养基和DMEM培养液均购自Thermo公司，Trizol总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和Liposuction 2000脂质体转染试剂盒均购自美国Invitrogen公司，SP免疫组织化学试剂盒购自北京欣兴唐生物科技有限公司，兔抗人Survivin多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，兔抗人GAPDH单克隆抗体试剂盒和兔抗人caspase-9多克隆抗体均购自福州迈新公司，细胞周期试剂盒和凋亡试剂盒均购自美国Bestbio公司，小鼠IL-6和人趋化因子(CCL5/Rantes)检测试剂盒均购自上海丰寿生物科技有限公司，siRNA Survivin、阳性对照GAPDH-siRNA、阴性对照错义链均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2方法

1.2.1实验动物及分组20只4～6周龄雌性BALB/c小鼠由河南省实验动物中心提供，体质量15～18 g，饲养于标准条件下(温度23 ℃左右、相对湿度50%～60%)，自由饮水及摄食。利用随机数字表随机分为实验组和对照组，每组10只。

1.2.2小鼠哮喘模型的构建及处理参考文献[5]方法构建小鼠哮喘模型，实验组：第1天将10%卵清清蛋白和10%氢氧化铝抗原溶液0.2 mL进行腹腔注射致敏，14 d后进行超声雾化吸入2.5%卵清清蛋白30 min左右诱发哮喘，等待小鼠出现呛咳、呼吸急促、烦躁、发绀等哮喘发作症状，每间隔1 d进行1次，连续进行42 d。对照组：第1天将生理盐水进行腹腔注射，后续处理与实验组相同，仅将生理盐水替换卵清清蛋白。所有小鼠在最后1次雾化处理后1 d进行颈椎脱臼处死，取气管和支气管进行细胞培养，对右肺中叶进行免疫组织化学染色。利用组织贴块法对小鼠气道壁平滑肌细胞进行培养，取培养第5代细胞进行后续实验处理。

1.2.3小鼠气道壁平滑肌细胞分组及处理对实验组和对照组培养的气道壁平滑肌细胞分别进行分组：磷酸盐缓冲液(PBS)对照组(加入PBS)、错义链对照组(转染错义链)和siRNA转染组(转染siRNA Survivin)，根据Survivin基因序列及siRNA设计原则，确定最佳的siRNA Survivin序列：GCA TTC GTC CGG TTG CGC T。将等量的1×106气道壁平滑肌细胞加入到6孔培养板中，放置到37 ℃恒温箱中培养，待细胞生长达到70%～80%融合时，将培养基换成不含血清DMEM行过夜培养。次日进行转染，严格按照试剂说明书进行操作，让siRNA最终浓度保持在30 nmol/L，混匀后，放置在37 ℃恒温箱培养，46 h后开始下面的使用。

1.2.4利用逆转录PCR(RT-PCR)检测气道壁平滑肌细胞中Survivin mRNA表达利用Trizol总RNA提取试剂盒对细胞中总RNA进行提取，利用逆转录试剂盒进行逆转录为cDNA。以获得的cDNA为模板进行PCR，Survivin引物序列为，上游：5′-ACG GGG GAG AGA CGC AGT CC-3′，下游：5′-GAC CGA GAC CGG GAC CTG GA-3′，以GAPDH作为内参，PCR反应条件：94 ℃预变性10 min，94 ℃变性 20 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸 30 s，连续进行36个循环。对获得的PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用Multi Gauge V3.1软件对获得的电泳图像进行分析获得Survivin mRNA相对表达量。

1.2.5利用蛋白免疫印迹法(Western blot)对气道壁平滑肌细胞中Survivin和caspase-9蛋白表达量提取培养气道壁平滑肌细胞中总蛋白，于4 ℃下3 500 r/min离心15 min，取上清液，保存于-20 ℃冰箱。利用BCA蛋白定量试剂盒对获得的蛋白浓度进行检测，取50 μg蛋白进行十二烷基-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并电转至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂奶粉进行封闭120 min，分别将一抗Survivin(1∶1 000)、caspase-9(1∶500)及内参加入后，4 ℃过夜，将二抗加入，利用双色红外荧光扫描系统对结果进行检测，计算蛋白相对量。

1.2.6采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测IL-6和CCL5水平取处理后48 h的气道壁平滑肌细胞上清液，利用ELISA法对IL-6和CCL5水平进行检测。

1.2.7四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法对细胞增殖情况进行检测取对数期生长的气道壁平滑肌细胞，将200 μL约含5 000个细胞接种于培养板，分别在培养2、3和4 d后终止培养，每次终止培养前4 h，将20 μL 5 mg/mL的MTT溶液加入后，培养4 h，将培养基去除后，继续往各孔加入200 μL DMSO，振荡至结晶溶解，利用全自动酶标仪对各孔进行检测。

1.2.8采用流式细胞仪对细胞凋亡情况及细胞周期进行检测取对数期生长的气道壁平滑肌细胞，消化后收集细胞，用4 ℃预冷PBS冲洗3次，利用结合缓冲液1 mL重新悬浮细胞(浓度1×106)，取细胞悬液100 μL计入流式管中，并加入20 μg/mL碘化丙啶(PI)10 μL，避光条件下放置20 min，利用流式细胞仪(购自美国Beckman Coulter公司)对细胞凋亡情况进行检测。另取消化后细胞，用预冷的70%乙醇固定过夜后，离心，收集细胞，用PBS洗涤3次，以100 μg/mL加入RNase A，于37 ℃恒温箱孵育25 min，加入PI 500 μL于4 ℃下避光25 min，利用流式细胞仪对细胞周期进行检测。

2结果

2.1小鼠哮喘模型构建鉴定对照组小鼠在模型构建过程中均未出现饮食、行为、呼吸节律异常，实验组小鼠在模型构建过程中出现了活动减少、呼吸节律不齐、急促、烦躁不安、四肢震颤、呛咳等表现，严重的甚至出现点头呼吸及口鼻紫绀。肺组织免疫组织化学显示，对照组小鼠气道上皮完整，未出现平滑肌增厚、炎性细胞浸润等现象；实验组小鼠气道上皮细胞出现破坏、炎性细胞浸润及平滑肌增厚等现象，提示构建小鼠哮喘模型成功，见图1。

2.2不同处理组Survivin基因表达和caspase-9蛋白表达RT-PCR结果显示，实验组中PBS对照组和错义链对照组小鼠气道壁平滑肌细胞中Survivin RNA相对表达量均高于对照组中PBS对照组和siRNA转染组，差异均有统计学意义(P<0.05)，实验组中siRNA转染组小鼠气道壁平滑肌细胞中Survivin RNA相对表达量均低于PBS对照组和错义链对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示，实验组中PBS对照组和错义链对照组小鼠气道壁平滑肌细胞中Survivin蛋白表达量均高于对照组中PBS对照组和siRNA转染组，而caspase-9蛋白表达量则低于对照组中PBS对照组和siRNA转染组，差异均有统计学意义(P<0.05)，实验组中siRNA转染组小鼠气道壁平滑肌细胞中 Survivin蛋白表达量均低于PBS对照组和错义链对照组，而caspase-9蛋白表达量则高于PBS对照组和错义链对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1、图1～3。

A：对照组;B：实验组。

图1　免疫组织化学检测小鼠哮喘模型肺组织

a：P<0.05，与PBS对照组相比；b：P<0.05，与错义链对照组相比；c：P<0.05，与对照组相比。

图1　RT-PCR检测实验组和对照组中Survivin基因表达

图2　Western blot检测实验组和对照组中

2.3不同处理组对气道壁平滑肌细胞合成分泌IL-6和CCL5水平的影响实验组中PBS对照组、错义链对照组和siRNA转染组气道壁平滑肌细胞合成分泌IL-6和CCL5水平均高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，实验组中siRNA转染组气道壁平滑肌细胞合成分泌IL-6和CCL5水平均低于PBS对照组和错义链对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

图3　Western blot检测实验组和对照组中

组别IL-6CCL5实验组 PBS对照组539.7±26.8c337.4±27.2c 错义链对照组522.8±19.7c318.6±21.5c siRNA转染组369.8±43.9abc262.5±35.7abc对照组 PBS对照组207.8±23.5142.5±18.9 错义链对照组196.5±20.4139.6±17.1 siRNA转染组184.7±16.9135.9±15.8

a：P<0.05，与PBS对照组相比；b：P<0.05，与错义链对照组相比；c：P<0.05，与对照组相比。

2.4不同处理组对气道壁平滑肌细胞增殖的影响实验组中PBS对照组、错义链对照组和siRNA转染组2～4 d细胞增殖量均高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；实验组中siRNA转染组2～4 d细胞增殖量均低于PBS对照组和错义链对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3　不同处理组对气道壁平滑肌细胞增殖的影响±s)

a：P<0.05，与PBS对照组相比；b：P<0.05，与错义链对照组相比；c：P<0.05，与对照组相比。

2.5不同处理组对气道壁平滑肌细胞周期及细胞凋亡的影响实验组中PBS对照组和错义链对照组气道壁平滑肌G0/G1期比例显著低于对照组，而S/G2期比例则高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，实验组中siRNA转染组气道壁平滑肌细胞G0/G1期比例高于PBS对照组和错义链对照组，而S/G2期比例则低于PBS对照组和错义链对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；实验组中PBS对照组和错义链对照组细胞凋亡率均低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，实验组中siRNA转染组细胞凋亡率则高于PBS对照组和错义链对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4　不同处理组对气道壁平滑肌细胞周期及细胞

a：P<0.05，与PBS对照组相比；b：P<0.05，与错义链对照组相比；c：P<0.05，与对照组相比。

3讨论

支气管哮喘作为一种气道炎症、重塑、高反应性的慢性进展性疾病，气道壁平滑肌细胞在气道重塑过程中发挥重要作用，不仅体现在细胞本身大量增殖及肥大，而且出现表现改变，分泌细胞因子的能力增加，而细胞因子又会促进气道壁平滑肌细胞增殖及分泌[5-6]。Survivin作为一种凋亡抑制蛋白，可结合细胞周期调控因子CDK4，激活CDK2/cyclin E，并使Rb发生磷酸化，加入细胞由G1期进入S期，同时，还可使CDK4结合复合物中释放出p21WAF1/CIP1，通过与caspase作用而对Fas介导的细胞凋亡进行抑制，从而加速细胞的恶性转化及异常增殖[7]。本研究有选择性的利用RNA干扰引起Survivin基因沉默，观察其对小鼠支气管哮喘模型气道壁平滑肌细胞增殖、凋亡及分泌功能的影响。

本研究参考有关文献[5]进行支气管哮喘小鼠模型构建，结果显示，构建的模型可反应支气管哮喘实际病理过程。本研究RT-PCR结果显示，实验组中PBS对照组和错义链对照组小鼠气道壁平滑肌细胞中Survivin RNA相对表达量均高于对照组中PBS对照组和siRNA转染组(P<0.05)，说明在支气管哮喘模型小鼠气道壁平滑肌细胞中Survivin基因呈高表达，从而抑制细胞凋亡而加速细胞增殖过程[8]，同时，实验组中siRNA转染组小鼠气道壁平滑肌细胞中Survivin RNA相对表达量均低于PBS对照组和错义链对照组(P<0.05)，说明在对Survivin基因有效抑制后，小鼠气道壁平滑肌细胞中Survivin基因呈低表达，进一步提示Survivin与气道壁平滑肌细胞异常增殖有关。Western blot结果进一步说明，Survivin蛋白在支气管哮喘小鼠气道壁平滑肌细胞中呈高表达，而其发挥生理作用可能通过与caspase-9蛋白相互作用而使细胞发生异常增殖[9]。

IL-6是重要的炎性因子，其水平升高可促使Th向Th2分化，而Th2功能亢进，则会加速支气管哮喘病程进展[10]，CCL5则是Th1相关趋化因子，对嗜酸性粒细胞具有正向趋化作用，而嗜酸性粒细胞浸润及数量与支气管哮喘发作及病情严重程度关系密切[11]。本研究结果显示，实验组中PBS对照组、错义链对照组和siRNA转染组气道壁平滑肌细胞合成分泌IL-6和CCL5水平均高于对照组(P<0.05)，实验组中siRNA转染组气道壁平滑肌细胞合成分泌IL-6和CCL5水平均低于PBS对照组和错义链对照组(P<0.05)，说明支气管哮喘小鼠模型中IL-6和CCL5水平增加，这可能与气道壁平滑肌细胞大量合成分泌IL-6和CCL5有关[12]，而抑制Survivin基因则可减少两者的分泌，结合本研究结果，实验组中siRNA转染组2～4 d细胞增殖量均低于BS液对照组和错义链对照组(P<0.05)，说明抑制Survivin基因可减少气道壁平滑肌细胞，从而减少了IL-6和CCL5分泌。

本研究结果显示，实验组中siRNA转染组2～4 d细胞增殖量均低于PBS对照组和错义链对照组(P<0.05)，实验组中siRNA转染组气道壁平滑肌细胞G0/G1期比例高于PBS对照组和错义链对照组，而S/G2期比例则低于PBS对照组和错义链对照组(P<0.05)，实验组中siRNA转染组细胞凋亡率则高于PBS对照组和错义链对照组(P<0.05)，说明抑制Survivin基因表达可有效抑制哮喘模型小鼠气道壁平滑肌细胞异常增殖，并加速细胞凋亡的发生，提示Survivin介导的细胞凋亡通路在气道壁平滑肌细胞异常增殖中发挥重要作用，特异性的对Survivin基因进行抑制可加速气道壁平滑肌细胞凋亡，从而阻止支气管哮喘发生的病理基础产生[13]。

综上所述，siRNA技术可特异性引起Survivin基因沉默，降低其在支气管哮喘模型小鼠气道壁平滑肌细胞中的表达，可加速气道壁平滑肌细胞凋亡发生，有效抑制细胞异常增殖及分泌功能，有望为进一步开展体内实验研究提供新的线索，并为支气管哮喘的基因治疗提供新的靶位。

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Effects of siRNA silencing of inhibitor of apoptosis protein gene on the proliferation of airway smooth muscle in bronchial asthma mice

Wang Tao,Han Na△

(TheSecondDepartmentofPulmonary,theAffiliatedHospital(NorthHospital)ofHebeiUniversity,Baoding,Hebei071000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of siRNA silencing of inhibitor of apoptosis protein gene on the proliferation of airway smooth muscle in bronchial asthma mice.MethodsTweenty female BALB/c mice were randomly divided into experimental group and control group.Mice in the experimental group were constructed asthma models.The trachea and bronchi were collected for cell culture.Respectively,the cultured airway smooth muscle cells in the experimental group and the control group were grouped:PBS control group (added to PBS solution),missense chain control group (transfected with missense chain) and siRNA transfection group (transfected with siRNA Survivin).The expressions of Survivin mRNA,Survivin protein and caspase-9 protein in airway smooth muscle cells were detected.The levels of IL-6 and CCL5 in cell supernatant were detected.ResultsRT-PCR results showed that,the relative expression levels of Survivin RNA of airway smooth muscle cells in the siRNA transfection group of the experimental group were lower than the PBS control group and missense chain group,the differences were statistically significant (P<0.05).Western blot results showed that,the expressions of Survivin proteins in the siRNA transfection group of the experimental group were lower than the PBS control group and missense chain control group,while the caspase-9 protein were higher,In the experimental group,the synthesis and secretion levels of IL-6 and CCL5 of airway smooth muscle cells in the siRNA transfection group were lower than the PBS control group and missense chain control group,the cell proliferations at 2-4 d in the siRNA transfection group were lower than the PBS control group and missense chain control group,the proportion of G0/G1phase in the siRNA transfection group were higher than the PBS control group and missense chain control group,but the proportion of S/G2phase were lower than the PBS control group and missense chain control group,cells apoptosis rates of the siRNA transfection group were lower than the PBS control group and missense chain control group,the differences were statistically significant(P<0.05).ConclusionsiRNA specific silencing Survivin gene could accelerate the airway smooth muscle cell apoptosis,and inhibit cell abnormal proliferation and secretion.

[Key words]bronchial asthma;Survivin;airway smooth muscle cells;proliferation

作者简介：王涛(1980-)，主治医师，本科，主要从事哮喘工作的研究。△通讯作者，Tel:13833212335;E-mail:694826581@qq.com。

doi:论著·基础研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.16.009

[中图分类号]R562.2+5

[文献标识码]A

[文章编号]1671-8348(2016)16-2186-04

(收稿日期：2015-11-18修回日期：2016-02-26)