接种不同乳酸菌改善纳豆芽孢杆菌发酵的全豆豆乳品质研究

武 旭，钱 和

(江南大学食品学院，江苏无锡 214122)



接种不同乳酸菌改善纳豆芽孢杆菌发酵的全豆豆乳品质研究

武 旭，钱 和*

(江南大学食品学院，江苏无锡 214122)

摘要[目的]改善纳豆芽孢杆菌发酵的全豆豆乳品质。[方法]利用纳豆芽孢杆菌和不同的乳酸菌共同发酵全豆豆乳，对发酵过程中发酵豆乳的微生物数量、纳豆激酶酶活、pH的变化以及豆乳的感官评分进行研究。[结果]试验表明，利用汉森商业乳酸菌菌种与纳豆芽孢杆菌共同发酵全豆豆乳，豆乳中乳酸菌与纳豆菌均能够良好生长，所得发酵豆乳感官评分最高、纳豆激酶酶活最高。[结论]研究改善了纳豆产品的风味，可为大豆深加工提供参考。

关键词发酵豆乳；混合发酵；乳酸菌；纳豆芽孢杆菌；纳豆激酶

纳豆是一种发酵大豆产品，是由蒸煮过的大豆接种纳豆芽孢杆菌发酵而成。国内外研究表明，纳豆具有多种保健功效，包括溶解血栓、抗菌消毒、降血压、抗氧化、助消化、维持肠道健康、防治骨质疏松、抗癌等作用[1]。纳豆的食疗作用显著，但纳豆有令人不悦的氨嗅味，在我国的消费低于其传统消费国日本。改善纳豆风味的主要方法有简单加以芥末酱油等调料、添加辅料[2]、控制发酵条件[3]、冷冻干燥[4]、超高压[5]、混合发酵[6]等。

传统纳豆是固体发酵。液体可以通过管道运输，发酵过程容易控制，规模易扩大，成分易控制，后续加工较为简单。采用豆浆，而非全豆进行发酵，扩大生产较为容易。传统豆制品加工中的制浆工艺，多去皮去渣，造成资源的浪费，同时也对环境造成了污染。以全豆豆浆为原料制备富含纳豆激酶的酸豆乳，对大豆进行全利用，避免了对环境的污染。

开发一款风味良好、加工工艺简单、价格低廉的富含纳豆激酶的产品，市场前景广阔，有利于纳豆这一健康食品的推广。利用全豆豆浆进行发酵，对大豆进行全利用，液体发酵易于工业化生产，基本无副产物产生。笔者利用乳酸菌产酸产香的性质，改善纳豆芽孢杆菌发酵带来的不良风味，通过混合菌种发酵，改善了产品的风味，同时也为大豆的深加工提供一个新思路，有利于提高大豆这种在我国种植广泛的农作物的附加值。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种。纳豆芽孢杆菌(Bacillusnatto)为实验室保存菌种；植物乳杆菌(L.plantarum，L.p)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus，L.a)、德式乳杆菌保加利亚亚种(L.delbrueckiisubsp.bulgaricus，L.db)、嗜热链球菌(S.thermophilus,S.t)、乳酸乳球菌乳亚种(L.lactis.subsp.lactis，L.l)，由江南大学生物技术实验中心提供；Hanson商业发酵菌株、Danisco商业发酵菌株、光明ST3商业发酵菌种，在该试验中缩写编号依次为H、D、S。

1.1.2主要试剂。纤维蛋白原、凝血酶、尿激酶，购自中国药品生物鉴定所；其他化学试剂均为分析纯。

1.1.3主要仪器设备。KS996初粉碎机；胶体磨，廊坊市廊通机械有限公司；高压均质机，上海市东华高压均质机厂；FE20型pH 计，祈合电器有限公司；LS-B50L高压蒸汽灭菌锅，上海医用核子厂；W-CJ-1FD 超净工作台，苏州安泰空气技术公司。

1.2方法

1.2.1种子液制备。保存的纳豆杆菌菌种由斜面接种到装有100 mL营养肉汤中，37 ℃下，180 r/min摇床培养16 h，制得纳豆菌种子液。乳酸菌菌种，分别由斜面接种到100 mL的MRS培养基中，放在37 ℃培养箱中培养16 h，制得乳酸菌种子液。

1.2.2全豆豆乳的制备。全豆豆乳制备工艺流程：大豆→清洗→浸泡→热烫→制浆→胶体磨→均质→杀菌→冷却→接种→发酵→冷藏→成品。选取颗粒饱满、无霉变、无劣质的优质大豆，洗净，以豆水比1∶3 g/mL的比例，4 ℃浸泡18 h，0.5%的NaHCO3溶液热烫，按豆水比1∶8 g/mL磨浆，过胶体磨，40 MPa均质。

1.2.3发酵豆乳的制备。按照“1.2.2”制得的全豆豆浆杀菌条件：115 ℃，15 min。冷却至40 ℃，按照1∶1比例接种纳豆芽孢杆菌和乳酸菌，37 ℃摇床发酵12 h，摇床转速100 r/min，37 ℃静置发酵8 h，冷藏后熟得到成品。

1.2.4菌落计数方法。纳豆菌数量依照GB 4789.2食品微生物检验菌落总数测定[7]，乳酸菌数量依照GB 4789.35测定[8]。

1.2.5纳豆激酶活力的测定。纤维蛋白平板法，参照并改良Astrup法制备双层纤维蛋白平板[9]，下层为2.5%的琼脂，上层为一支纤维蛋白原。先溶于3 mL 37 ℃无菌水中，再溶于20 mL已灭菌的巴比妥纳缓冲液中；另取0.6 g琼脂糖溶于40 mL巴比妥纳缓冲液中灭菌冷却至60 ℃，二者迅速混匀，加入人凝血酶300 μL(20 U/mL)，摇匀倒入4个Φ 9 mm已凝固的琼脂平板上层，静置1 h，用3 mm打孔器打孔，将尿激酶标准品(20、40、60、80、100、120、140、160 U/mL)各7 μL点样于新配制的纤维蛋白平板上，放置10 min，移入37 ℃培养箱，保温17 h后取出测定溶栓圈的垂直直径，并以垂直直径乘积(cm2)为横坐标，以尿激酶浓度(U/mL)为纵坐标作图，得标准曲线。

测定时取纳豆激酶样品用巴比妥纳缓冲液稀释至适当浓度，取7 μL点样于纤维蛋白平板上，并以80 U/mL尿激酶作为标准对照，测量其形成透明圈2条相互垂直的直径，并计算其面积，据标准曲线计算样品活力Y值(U/mL)。其中样品的X值=样品溶栓圈直径乘积(cm2)/校正系数f；f=样品平板尿激酶对照溶栓圈直径乘积(cm2)/标准曲线中相对应的尿激酶溶栓圈直径乘积(cm2)。

1.2.6pH的测定。采用酸度计直接测定。

1.2.7产品感官评价。由5名男生和5名女生组成感官鉴评小组，并接受感官鉴定培训。小组成员要求对酸豆乳的表观、气味、风味和质地指标进行评价，感官审评评分标准见表1。

表1　感官评价评分标准

2结果与分析

当乳酸菌与纳豆菌同时接种，静置培养时，乳酸菌生产迅速，成为优势菌落，产酸、消耗大量营养物质，使纳豆菌无法快速生长。所以，纳豆芽孢杆菌与乳酸菌共同发酵中，应使纳豆菌先大量生长，可在接种纳豆芽孢杆菌一段时间后再接种乳酸菌[10]，也可以在同时接种后，通过控制发酵条件，促进纳豆芽孢杆菌生长[11]。

在同时接种后，进行摇床培养，增加培养基溶氧量，促进好氧的纳豆菌快速生长，进而积累纳豆激酶等发酵产物；在此发酵后期，改为静置培养。发酵前期纳豆芽孢杆菌的大量生长造成培养基的低溶氧状态；同时乳酸菌水解蛋白质能力较弱，而纳豆芽孢杆菌水解蛋白质的酶系较强，为乳酸菌提供了氮源。这些因素促进了乳酸菌的生长，从而产生了良好的风味。乳酸菌发酵产酸，乳酸、乙酸的积累，最终也会抑制纳豆芽孢杆菌、乳酸菌的生长。同时，乳酸菌、纳豆芽孢杆菌竞争营养物质，二者的关系复杂，希望筛选出一株能与纳豆芽孢杆菌良好共生且能改善纳豆不良风味的乳酸菌菌种。

2.1不同乳酸菌菌种对全豆纳豆豆乳中纳豆芽孢杆菌、乳酸菌数量的影响由表2可见，7个试验组，只有L.l不能与纳豆芽孢杆菌良好共生，在前期摇床培养时，乳酸菌活菌数显著下降，后期静置培养时，乳酸菌活菌数略有上升；其余6个试验组中，乳酸菌与纳豆菌都能在豆浆体系中良好共生。L.p和S为植物乳杆菌，发酵所得的豆乳中乳酸菌活菌数较高，分别为(9.24±0.13) lg(CFU/mL)、(9.97±0.04 )lg(CFU/mL)，这可能是因为植物乳杆菌能够利用的碳源种类较多。此外，3种商业菌种发酵的豆乳中乳酸菌活菌数较高。

2.2不同试验组的纳豆激酶酶活变化

2.2.1尿激酶标准曲线。图1为尿激酶的标准曲线，以垂直直径乘积为横坐标，尿激酶活性为纵坐标，标准曲线方程y=-55.250 78+1.232 98x,R2=0.992 8。

2.2.2纳豆激酶酶活力的变化。由图2可见，L.l试验组纳豆激酶活力最高，这与“2.1”中活菌数的结果相吻合，该试验组乳酸菌生长受抑制，纳豆芽孢杆菌获得营养物质充足，生长旺盛，因而其代谢产物纳豆激酶积累较多，酶活较高。

整个发酵过程中，除L.l，其余6个试验组的纳豆激酶酶活均呈现先上升后下降趋势。在发酵前期，纳豆芽孢杆菌大量生长，积累代谢产物，纳豆激酶酶活上升；而在后期，乳酸菌生长加快，与纳豆菌竞争营养物质，同时体系的pH快速下降，混合发酵豆乳中的纳豆激酶酶活下降。发酵结束时，混合发酵豆乳中纳豆激酶酶活从高到低依次为L.l、H、S、L.p、S.t+L.d、L.a、D，分别为388.8、300.8、282.0、264.0、235.5、215.2、200.0 U/mL。

2.3不同乳酸菌菌种对全豆酸豆乳pH的影响由图3可见，L.p、L.l、S这3个试验组，在发酵前期，豆乳的pH先上升，主要原因是，前期纳豆芽孢杆菌大量生长，占据优势地位，并水解大豆蛋白产生氨基酸以及肽段；发酵后期，豆乳的pH下降，是由于乳酸菌大量生长，产生乳酸，这又抑制了纳豆芽孢杆菌的生长。

表2　乳酸菌和纳豆菌活菌数的变化

图1　尿激酶标准曲线Fig.1　Standard curve of uokinase

图2　发酵豆乳中纳豆激酶酶活性的变化Fig.2　Change of the activity of nattokinase in fermented soymilk

S.t+L.d、L.a、D、H 4个试验组在发酵的过程中，pH整体呈下降趋势，发酵初期下降较慢，发酵后期下降较快，整体呈下降趋势。这是因为这4个试验组乳酸菌在发酵豆乳体系中生长良好，同时产酸能力较强。前期pH下降速度较慢的原因是，纳豆芽孢杆菌水解大豆蛋白产生了氨基酸、肽段，这对于pH的下降有延缓作用。

发酵结束时，各个试验组所得的发酵豆乳的pH由高到低依次为L.l、L.p、D、S、S.t+L.d、H、L.a，分别为6.39、4.88、4.67、4.63、4.45、4.27、4.17。

图3　发酵豆乳中pH的变化Fig.3　Change of pH value in fermented soymilk

2.4不同乳酸菌菌种对全豆酸豆乳感官评分的影响根据制定的评分表进行感官评定，结果如表3所示。利用纳豆芽孢杆菌与乳酸菌共同发酵，利用乳酸菌发酵产酸产香的特性，改善纳豆芽孢杆菌单独发酵产生的不良风味。因而，感官品质是菌种筛选时考虑的重要指标之一。

表3　发酵豆乳的感官评分

注：右上角标的小写英文字母表示每一列数值之间的差异显著性(P<0.05)。

Note：Difference among lowercase letters in same column:P<0.05.

由表3可见 ，L.l组香气、滋味、总体接受程度评分均为最低，这是因为乳酸乳球菌乳亚种在混合发酵豆乳体系中生长不旺盛，因而代谢产物较少，对混合发酵豆乳风味改善作用弱。除了L.l试验组，各组的色泽评分没有显著差异。S.t+L.d试验组，组织状态评分显著低于除了L.l的5组。已有报道指出，发酵豆乳中蛋白质的等电点在pH 4.5左右[12]。发酵豆乳的最佳pH在4.2～4.3[13]。S.t+L.d试验组发酵结束时pH为4.45，与4.5很接近，蛋白质体系不稳定对发酵豆乳的质构产生不良影响。S、D、H 3个试验组所用的乳酸菌均为商业菌种，发酵豆乳的香气、滋味、总体接受程度都较高，其中H试验组的感官总体接受程度最高。

3结论

该试验利用不同乳酸菌与纳豆芽孢杆菌共同发酵，制作全豆豆乳，考察了各试验组在发酵过程中活菌数、酶活、pH的变化规律并对发酵豆乳的感官质量进行评分。试验表明，H组汉森商业乳酸菌菌种能与纳豆芽孢杆菌一起在豆乳体系中良好生长，所得发酵豆乳感官评分总体接受度最高，纳豆激酶酶活最高。综合各项指标，选用汉森商业乳酸菌作为与纳豆芽孢杆菌共同发酵豆乳的乳酸菌菌种。

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作者简介武旭(1991- )，女，江苏连云港人，硕士研究生，研究方向：食品资源综合利用。*通讯作者，教授，博士，博士生导师，从事食品安全研究。

收稿日期2016-03-30

中图分类号TS 214

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)13-065-04

Improvement of the Quality of the Soybean Milk Fermented withBacillusnattothrough the Inoculation of Different Lactobacillus Strains

WU Xu, QIAN He*

(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122)

Abstract[Objective] The quality of soybean milk fermented with Bacillus natto was improved through the experiment. [Method] The Bacillus natto and different lactobacillus strains were used to ferment whole soybean milk.The change of microbial counts, activity of nattokinas, pH and sensory scores during its fermentation process was studied. [Result] The experimental result showed that the Hansen commercial lactobacillus and Bacillus natto, which were used in the soybean milk fermentation, could grow well.Both the sensory score of the fermented soymilk and the activity of enzyme and natto were highest. [Conclusion] The flavor of natto products is improved and the reference for soybean processing was provided.

Key wordsFermented soymilk; Co-fermentation; Lactobacillus; Bacillus natto; Nattokinase