菠萝蜜果实成熟过程中香气物质形成相关酶的活性变化

刘鑫泉，段小强，李映志，李 莹，覃 芳，叶春海

(广东海洋大学农学院，广东湛江 524088)



菠萝蜜果实成熟过程中香气物质形成相关酶的活性变化

刘鑫泉，段小强，李映志*，李 莹，覃 芳，叶春海*

(广东海洋大学农学院，广东湛江 524088)

摘要[目的]分析菠萝蜜果实成熟过程中香气物质形成相关酶的活性变化，确定对菠萝蜜果实香气物质形成起关键性作用的酶，为菠萝蜜栽培及育种提供理论支撑。[方法]以不同基因型的菠萝蜜为材料，分别以亚油酸钠、氢过氧化亚油酸钠、乙醛和丁醇为底物，测定脂氧合酶(LOX)、氢过氧化物裂解酶(HPL)、醇脱氢酶(ADH)和醇酰基转移酶(AAT)在果实成熟过程中的活性变化。[结果]在果实成熟过程中，LOX在果实成熟早期具有较高活性，在香气物质合成的前期起主要作用；HPL主要参与菠萝蜜果实中醛类香气的形成；ADH活性水平较高；AAT活性变化在种质间存在差异，在果实成熟末期活性增强或略有下降。[结论]AAT是菠萝蜜果实特征香气物质形成的关键酶。

关键词菠萝蜜；脂氧合酶；氢过氧化物裂解酶；醇脱氢酶；醇酰基转移酶

菠萝蜜(ArtocarpusheterophyllusLam.)是桑科(Moraceae)木菠萝属(Artocarpus)植物，又称“ 树菠萝”“木菠萝”，被誉为“热带珍果”“热带水果皇后”[1-2]。其原产印度，是世界著名热带果树，我国引入菠萝蜜已有一千多年历史，现在广东、广西、海南、云南、福建和四川南部以及台湾均有栽培，以广东雷州半岛和海南种植最多[3]。

果实香气能客观地反映不同果实的风味特点和成熟程度，是与人类健康和营养密切相关的果实品质[4]。对菠萝蜜果实香味品质进行研究，不仅可以揭示菠萝蜜果实香气形成机理，而且对改善菠萝蜜香味品质并指导其育种实践具有积极意义。果实香气物质是由果实组织中一些前体物质在酶的作用下通过一定的生化途径形成的。参与香气合成的关键性酶主要有脂氧合酶(LOX)、氢过氧化物裂解酶(HPL)、乙醇脱氢酶(ADH)和醇酰基转移酶(AAT)等。目前我国学者对这4种酶的研究较多[5-19]，然而在菠萝蜜果实香气的研究中，主要集中在果实香气成分测定及特征香气的分析等方面，而对于香气合成的途径、生理机制以及分子水平的研究鲜见报道。笔者对菠萝蜜果实香味品质形成相关的LOX、HPL、ADH和AAT的活性进行测定，以期了解菠萝蜜果实成熟过程中香味物质代谢相关酶的活性变化规律，确定菠萝蜜果实香味品质形成的主要贡献酶，为进一步开展菠萝蜜品质育种和栽培技术的研究提供理论支持。

1材料与方法

1.1材料菠萝蜜均为广东海洋大学农学院收集的菠萝蜜种质，包括13Bs、13Ds、13Ks和13Ls 4个菠萝蜜品种。从各种质的同一植株上分别采集未成熟果实和八成熟果实，未成熟果立即采样，八成熟果在室温放置并分阶段采样。每个果实采3份果苞样品，液氮速冻后，置于-80 ℃超低温保存备用。

4个不同成熟度分别为：成熟度I，果实未成熟，发育基本完成，果外无香气，果实生硬，敲打声音清脆；成熟度II，果实八成熟，果外有轻微香气，果实未软化，敲打声音轻微沉闷；果实成熟度III，采后2 d，九成熟，果外有浓郁香气，果肉开始软化，敲打声音沉闷；果实成熟度IV，采后4 d，完全成熟，果外有浓郁香气，果实完全软化，敲打声音沉闷。

1.2方法

1.2.1LOX活性测定。参照Axelrod等[20]的方法，并加以改进。以10 mmol/L亚油酸钠为酶反应底物，在研钵中加5 mL预冷的0.5 mol/L(pH 7.0)Tris-HCl缓冲液。称取1.0 g 菠萝蜜果肉，充分研磨，离心，上清液用于LOX 活性测定。酶活性的测定采用3 mL 反应体系，其中，亚油酸钠母液100 μL，缓冲液2 700 μL，粗酶液200 μL。在室温(25 ℃)下反应，于234 nm 处测定消光值。加酶液15 s 后开始计时，记录1 min 内OD234的变化，酶活性以ΔOD234/(gFW·min) 表示，重复3 次。

1.2.2HPL活性测定。参照Vick[21]的方法，并加以改进。酶反应底物为氢过氧化亚油酸钠，制备方法：10 mL蒸馏水，200 μL 10 mmol/L亚油酸钠，400 μL LOX酶液(0.1 mg/mL硼酸缓冲液，pH 9.0)，底物30 ℃水浴2 h。在研钵中加4 mL预冷的提取液：150 mmol/L HEPES-KOH缓冲液(pH 8.0)，250 mmol/L山梨醇，10 mmol/L EDTA，10 mmol/L MgCl2，l %(V/V)甘油，4% PVPP，0.1 mmol/L PMSF。称取1.0 g 菠萝蜜果肉，充分研磨，离心，上清液用于HPL活性测定。酶活性测定采用3.5 mL反应体系:2 mL分析缓冲液(150 mmol/L HEPES-KOH，pH 8.0；250 mmol/L山梨醇；10 mmol/L EDTA；10 mmol/L MgCl2)，反应底物液0.75 mL，1.6 mmol/L NADH 0.15 mL，0.1 mL ADH酶液(0.5 mg/mL硼酸缓冲液，pH 8.6)，粗酶液0.5 mL，反应温度30 ℃，于340 nm下测定HPL活性。加酶液后15 s开始计时，记录1 min内OD值变化，酶活性以△OD340/(gFW·min)表示，重复3次。

1.2.3ADH活性测定。参照Longhurst等[22]的方法，并加以改进。在研钵中加入4 mL预冷的提取液：100 mmol/L MES-Tris缓冲液(pH 6.5)，2 mmol/L DTT，1% PVP。称取1.0 g 菠萝蜜果肉，充分研磨，离心，上清液用于ADH活性测定。酶活性测定采用3 mL反应体系：2.4 mL MES-Tris缓冲液(pH 6.5)，0.15 mL l.6 mmol/L NADH，0.15 mL 80 mmol/L乙醛，0.3 mL粗酶液，反应温度30 ℃，于340 nm下测定ADH活性。加酶液后15 s开始计时，记录1 min内OD值变化，酶活性以 △OD340/(gFW·min)表示，重复3次。

1.2.4AAT活性测定。参考隋静等[16]的方法，并加以改进。在研钵中加入7.5 mL预冷的蛋白提取液(0.5 mol/L Tris-HCL(pH 8.0)，0.1%(V/V)Triton X-100，0.3 mg/L PVPP)。称取1.0 g 菠萝蜜果肉，充分研磨，冰浴，离心，上清液用于AAT活性测定。酶活性测定采用DTNB比色法。反应液组成：2.5 mL MgCl2溶液(0.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.0，其中含0.5 mmol/L MgCl2)，150 μL acetyl-CoA溶液(0.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.0，其中含0.5 mmol/L acetyl- CoA)，50 μL丁醇溶液(0.5 mo l/L Tris-HCl，pH 8.0，其中含20 mmol/L丁醇)和150 μL酶提取液。将以上组分混合后置于35 ℃水浴15 min，然后添加100 μL 1 mmo l/L DTNB，在室温下放置10 min，412 nm处比色，用不含酶提取液的反应液为空白，每样品重复 3次，测定1 min内吸光度升高的数值，酶活性以 △OD412/(gFW· min)表示，重复3次。

2结果与分析

2.1菠萝蜜果实成熟过程中LOX活性的变化由图1可知，不同品种、不同成熟阶段的LOX活性变化差异很大。在果实成熟第1阶段到第2阶段，所有品种的LOX活性均呈下降趋势，其中，13Ds从0.121 △OD234/(gFW·min)下降到0.049△OD234/(gFW·min)，13Ks从0.130△OD234/(gFW·min)下降到0.065△OD234/(gFW·min)，分别下降了59%和50%，下降幅度较大，其余品种在此阶段酶活性下降幅度相对较小。品种13Ks的LOX活性在成熟过程中逐渐降低，从0.130△OD234/(gFW·min)下降到0.037△OD234/(gFW·min)，下降了71%；13Ds的LOX活性则呈先下降后上升再下降的趋势，且变化幅度较大；品种13Bs和13Ls均呈先下降后上升的趋势，13Bs总体活性水平较高，13Ls总体活性水平较低。总体而言，LOX活性在果实成熟过程中呈下降趋势，且在果实未成熟阶段高于成熟阶段。

图1　菠萝蜜果实成熟过程中LOX活性的变化Fig.1　Activity of lipoxygenase during jackfruit fruit-ripening

2.2菠萝蜜果实成熟过程中HPL活性的变化由图2可知，HPL活性变化在品种间存在很大差异。13Ds的HPL活性呈先下降后上升的趋势，最低值出现在果实成熟的第3阶段，为0.028△OD340/(gFW·min)，下降了63%。13Bs的酶活性在果实成熟的第2阶段均略有上升，酶活性增加了46%，随后下降了60%，在完全成熟阶段则又上升了22%。13Ks的HPL活性变化趋势与13Bs相似，也呈先上升后稍下降再上升的趋势，且13Ks的HPL活性较13Bs 高。13Ls在果实成熟过程中酶活性逐渐降低。HPL的酶活性变化，除13Ls的逐渐降低外，其他品种在成熟过程中，均在果实成熟的第2阶段(13Bs和13Ks)和完全成熟阶段(13Ds)出现峰值。

图2　菠萝蜜果实成熟过程中HPL活性的变化Fig.2　Activity of hydroperoxidelyase during jackfruit fruit-ripening

2.3菠萝蜜果实成熟过程中ADH活性的变化由图3可知，ADH总体活性较高。13Ds的酶活性在果实成熟第1阶段至第3阶段从0.161△OD340/(gFW·min)上升到0.213△OD340/(gFW·min)，上升了32%，至成熟期下降了26%。13Ks的酶活性从0.098△OD340/(gFW·min)上升到0.121△OD340/(gFW·min)，上升了23%，接着下降了8%，后又上升了1%。13Bs的酶活性从0.137△OD340/(gFW·min)开始下降，至果实成熟第2阶段达最低值0.136△OD340/(gFW·min)，下降了0.4%，随后开始上升，至果实完全成熟时活性最高，为0.192△OD340/(gFW·min)，较最低值上升了41%。 13Ls从0.204△OD340/(gFW·min)开始下降，至果实成熟第3阶段活性最低，为0.006△OD340/(gFW·min)，下降了97%，后一直处于较低的活性水平。

图3　菠萝蜜果实成熟过程中ADH活性的变化Fig.3　Activity of alcohol dehydrogenase during jackfruit fruit-ripening

2.4菠萝蜜果实成熟过程中AAT活性的变化由图4可知，13Bs的AAT活性从0.001 3△OD412/(gFW·min)上升到0.002 0△OD412/(gFW·min)，上升了53%，之后又下降到0.000 8△OD412/(gFW·min)，下降了60%，接着又上升到0.001 7△OD412/(gFW·min)，上升了113%。13Ks的酶活性呈先下降后连续上升的趋势，AAT活性最小值均出现在果实成熟第2阶段，为0.001 6△OD412/(gFW·min)，至果实成熟第4阶段为0.002 0△OD412/(gFW·min)，上升了25%。13Ls的AAT活性呈先上升后下降的趋势，13Ls的酶活性从0.001 7△OD412/(gFW·min)上升到0.002 3△OD412/(gFW·min)，上升了35%，后连续下降至0.000 7△OD412/(gFW·min)，下降了70%。仅13Ds的酶活性在果实成熟过程中持续降低，下降了57%。由此可知，AAT在不同品种果实成熟过程中酶活性变化存在一定的差异，但在果实成熟后期酶活性均有一定的增加。

图4　菠萝蜜果实成熟过程中AAT活性的变化Fig.4　Activity of alcoholacy ltransferases during jackfruit fruit-ripening

3结论与讨论

该研究结果表明，LOX在4个菠萝蜜品种(13Bs、13Ds、13Ks和13Ls)果实成熟过程的第1阶段到第2阶段活性均下降，且在13Ks品种成熟过程中活性逐渐降低，而在品种13Bs和13Ls中虽呈先下降后上升的趋势，但在未成熟果实中的酶活性高于成熟果实，说明LOX活性在果实成熟过程中逐渐降低，这与李岩[23]在薄皮甜瓜中研究结果相似，说明LOX是菠萝蜜果实香气物质合成前期起主要作用的酶。

HPL活性在13Bs和13Ks果实成熟的第2阶段出现峰值，而在13Ds的完全成熟阶段出现峰值。HPL在脂氧合酶之后达到活性峰值，说明HPL催化LOX酶的产物——脂氢过氧化物形成短链醛和含氧酸，HPL是植物产生清香型香味的关键酶[24]。

相比于LOX和HPL，ADH活性总体较高。ADH在13Ds和13Ks品种中呈先上升后下降的趋势，刘朝蓬等[24]测定了不同品种柿果实ADH活性，结果表明，ADH活性在不同品种中存在差异，但总体呈先上升后下降的趋势。该研究中13Ls在果实成熟过程中活性持续下降，与品种13Ds和13Ks及刘朝蓬等[24]在柿果实中的研究结果不一致，而与许传强等[25]在网纹甜瓜中的研究结果一致。由此可知，不同水果种类、相同种类水果不同品种之间ADH的活性存在不同的变化趋势，很可能与果实的香气类型有关。

AAT是果实酯类物质合成的关键酶。该研究中，不同品种、不同阶段的AAT活性变化仍有差别。13Bs果实成熟过程中AAT活性呈先上升后下降至果实完全成熟阶段再上升的变化趋势，而13Ks活性变化均呈先下降后连续上升趋势。AAT在果实成熟过程中的活性变化总体为上升趋势。在前人对菠萝蜜果实香气成分的研究中，确定酯类香气是菠萝蜜果实的特征香气[26]。因而，AAT在果实成熟后期增加，催化生成菠萝蜜特征香气的酯类物质含量增加。隋静等[16]在对草莓果实成熟过程中香气物质与AAT活性变化的研究中发现，AAT活性逐渐上升，且酯类香型草莓品种的AAT活性更高，与该研究结果一致，进一步证实AAT在酯类物质合成中的关键性作用。

参考文献

[1] 李秀娟，钟敏.菠萝蜜种子淀粉颗粒性质的研究[J].食品科学，2004，25(6)：69-74.

[2] 毛琪，叶春海，李映志，等.菠萝蜜研究进展[J].中国农业科学，2007，23(3)：439-443.

[3] 赖小玲，何春林，黄义，等.菠萝蜜种子淀粉提取及其理化性质的研究[J].食品与发酵工业，2006，32(10)：132-136.

[4] 陈明，向妙莲.果实香气合成研究进展[J].现代园艺，2011(6)：17-20.

[5] 生吉萍，申琳，罗云波.果蔬成熟和衰老中的重要酶——脂氧合酶[J].果树科学，1999，16(1)：72-77.

[6] DA SILVA FORTUNATO F，GORETIDE M，OLIVEIRA A，et al.Lipoxygenase induced defense of soybean varieties to the attack of the velvet bean caterpillar [J].J Pest Sci，2007，80：241-247.

[7] FERRIE B J，BEAUDOIN N，BURKHART W.The cloning of two tomato lipoxygenase genes and their diffieultial expression during fruit ripening[J].Plant physiology，1994，106：109-118.

[8] 张波，李鲜，陈昆松.EST 库的猕猴桃脂氧合酶基因家族成员的克隆[J].园艺学报，2008，35(3)：337-342.

[9] ZHANG B，SHEN J Y，WEI W W，et al.Expression of genes associated with aroma formation derived from the fatty acid pathway during peach fruit ripening[J].Journal of agricultural and food chemistry，2010，58(10)：6157-6165.

[10] PORTA H，ROCHA-SOSA M.Lipoxygenase in bacteria：A horizontal transfer event [J].Microbiology，2001，147：31999-32001.

[11] 熊杰，刘庆庆，孔祥珍，等.从苋菜中提取氢过氧化物裂解酶工业[J].食品与发酵工艺，2011，37(12)：189-192.

[12] VANCANNEYT G，SANZ C，FARMAKI T，et al.Hydroperoxide lyase depletion in transgenic potato plants leads to an increase in aphid performance[J].Proceedings of the national academy of sciences，2001，98：8139.

[13] 梁银娜，李宝.柿果实乙醇脱氢酶酶学特性研究[J].中国农业大学学报，2011，16(5)：65-70.

[14] PINHERO R G，COPP L J，AMAYA C L，et al.Roles of alcohol dehydrogenase，lactate dehydrogenase andpyruvate decarboxylase in low-tenperature sweetening in to lerantand susceptible varieties of potato(Solanumtuberosum)[J].Physiologia plantarum，2007，130：230-239.

[15] KANELLIS A K，SOLAMOS T，ANGELAK K A.Suppression of cel-lulose and polygalacturonase and induction of alcohol dehydrogenaseisoenzymes in avocado fruit me so carp subjected to low oxygen stress[J].Plant physiology，1991，96：269-274.

[16] 隋静，姜远茂，彭福田，等.草莓果实发育过程中芳香物质含量和醇酰基转移酶活性的变化[J].园艺学报，2007，34(6)：1411-1417.

[17] 曹颖，胡尚连，张慧莹，等.西红柿醇酰基转移酶基因 SlAAT1 克隆、序列分析和原核表达[J].植物研究，2012，32(6)：731-736.

[18] SOULEYRE E J F， GREENWOOD D R， FRIEL E N， et al.An alcohol acyl transferase from apple (cv. Royal Gala)，Mp AAT1，produces esters involved in apple fruit flavor[J].FEBS J，2005，272：3132-3144.

[19] PIRONA R，VECCHIETTI A，LAZZARI B，et al.Expression profiling of genes involved in the formation of aroma in two peach genotypes[J].Plant biology，2013，15：443-451.

[20] AXELROD B,CHEESBROUGH T M,LEAKSO S.Lipoxygenase from soybeans[J].Methods in enzymology,1981,7:443-451.

[21] VICK B A.A spectrophotometric assay for hyderperoxide lyase[J].Lipids,1991,26:315-320.

[22] LONGHURST T J,TUNG J F,BRADY C J.Developmental regulation of the expression of alcohol dehydrogenase in ripening tomato fruit[J].Food biochemistry,1990,14:421-423.

[23] 李岩.乙烯在薄皮甜瓜果实香气物质合成中的作用与调控[D].沈阳：沈阳农业大学，2012.

[24] 刘朝蓬，郑仲明，梁银娜.柿树乙醇脱氢酶活性与可溶性单宁含量的关系[J].园艺学报，2008，35(5)：741-746.

[25] 许传强，韩玉雪，杨琳.嫁接对网纹甜瓜果实中四种特征酯类香气物质含量及其合成相关酶活性的影响[J].北方园艺，2011(16)：41-44.

[26] 李洪波，李映志，叶春海，等.顶空固相微萃取和气相色谱-质谱法测定菠萝蜜果肉中的香气成分[J].热带作物学报，2013，34(4)：755-763.

基金项目国家自然科学基金项目(31101506)；广东省科技计划项目(2013B020304004)。

作者简介刘鑫泉(1988- )，男，河北唐山人，硕士研究生，研究方向：热带园艺作物遗传育种。*通讯作者，李映志，教授，博士，硕士生导师，从事南亚热带果树生物技术与育种研究；*通讯作者，叶春海，教授，博士，博士生导师，从事南亚热带果树生物技术与育种研究。

收稿日期2016-03-30

中图分类号S 667.8

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)13-141-03

Research on the Activity of Lipoxygenase, Hydroperoxide Lyase, Alcohol Dehydrogenase and Alcohol Acyl Transferases in Jackfruit Fruit-ripening

LIU Xin-quan，DUAN Xiao-qiang，LI Ying-zhi*, YE Chun-hai*et al

(Agricultural College, Guangdong Ocean University，Zhanjiang, Guangdong 524088)

Abstract[Objective]The key enzymerelated to the aroma formation in jackfruit(Artocarpus heterophyllus Lam.) fruit was determined through the analysis of the activitychange of enzymesduring its fruit ripening, which could provide the theoretical support for its cultivation and breeding. [Method]The change in the activity of lipoxygenase, hydroperoxidelyase, alcohol dehydrogenase and alcohol acyl transferases during jackfruits’fruit ripeningwas tested based the linoleic acid, sodium hydroxide, sodium peroxide, linoleic acid, acetaldehyde and butanol being taken as a substrate respectively. [Result] During jackfruit fruit ripening, the activity of LOX was high at early period of fruit maturity and for aroma formation the major role of LOX was in the synthetic substance in early jackfruit growth period. HPL was mainly involved in the formation of aldehydes. The activity of ADH maintained at a high level. The activity of AAT existed difference among germplasm resources, it increased or slightly decreased at the end of fruit maturity period. [Conclusion]AAT is the critical enzyme in the formation of characteristic aroma of jackfruit fruit.

Key wordsJackfruit; Lipoxygenase; Hydroperoxide lyase; Alcohol dehydrogenase; Alcohol acyl transferases