高效液相色谱法测定“天竺痫康宁胶囊”中胆红素的含量

张　颖，宋志钊，刘　元

(广西壮族自治区中医药研究院中药所　广西中药质量标准研究重点实验室，广西 南宁　530022)



高效液相色谱法测定“天竺痫康宁胶囊”中胆红素的含量

张颖，宋志钊，刘元

(广西壮族自治区中医药研究院中药所广西中药质量标准研究重点实验室，广西 南宁530022)

摘要：目的建立天竺痫康宁胶囊胆红素含量的高效液相色谱(HPLC)测定方法。方法采用Intersil-C18色谱柱，流动相为甲醇-三氯甲烷-1%磷酸(80∶14∶6)，流速1.0 mL·min-1，检测波长为450 nm，柱温为室温，进样量为10 μL。结果在该条件下，浓度为2.26～45.2 mg·L-1范围内，胆红素峰面积与其浓度呈良好线性关系(r=0.999 6)，平均回收率为97.4%，RSD为2.02%(n=6)。结论该方法灵敏、简便、准确、重复性好，可作为天竺痫康宁胶囊质量标准的控制指标之一。

关键词：胆红素/分析；色谱法,高压液相；天竺黄；胆南星；中草药

天竺痫康宁胶囊为南宁翠湖医院院内制剂，由胆南星、天竺黄、人工牛黄、钩藤、天麻、远志、冰片、甘草等二十一味药材组成，具有清化热痰，息风定惊，开窍定痫等功效，用于痰火内盛所致之痫证发作。原标准采用人工牛黄、冰片、甘草3个薄层鉴别作为质量控制手段，为了提高该制剂质量标准，本文参考文献[1]建立高效液相色谱法(HPLC)测定胆红素的含量，以提高该药质量标准。

1仪器与试药

1.1仪器Waters1525高效液相色谱仪，Waters2998紫外检测仪；Empowers 2色谱工作站及软件；梅特勒AL104型电子分析天平；KQ-100VDB双频数控超声清洗仪。

1.2试剂与试药胆红素对照品(中国食品药品检定研究院提供，供含量测定用，批号10077-201206，含量以98.5%计；天竺痫康宁胶囊(广西忠宁制药有限公司、批号为：130901、130902、130903)；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余所用试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：Intersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-三氯甲烷-1%磷酸(80∶14∶6)；流速为1.0 mL·min-1；检测波长为450 nm，进样量为10 μL；柱温为室温；理论塔板数按胆红素峰计算应不低于2 000。

2.2线性范围考察精密称取胆红素对照品适量置于棕色量瓶中，用三氯甲烷溶解，制成0.452 g·L-1胆红素对照品溶液，精密吸取适量，以三氯甲烷稀释10倍得45.2 mg·L-1的胆红素对照品储备液。精密吸取45.2 mg·L-1的胆红素对照品储备液，分别稀释制成2.26、4.52、9.04、18.1、27.1、45.2 mg·L-1的胆红素对照品工作溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样10 μL，测定，以浓度C(mg·L-1)为横坐标，峰面积A为纵坐标，计算，得回归方程为：A=53 814C-63 451，r=0.999 6。结果表明：胆红素进样浓度在2.26～45.2 mg·L-1之间与峰面积积分值呈线性关系。

2.3供试品溶液的制备取本品研细，混匀，取细粉约2 g，精密称定，置具塞棕色瓶中，加三氯甲烷25 mL，超声处理10 min，放冷，加三氯甲烷至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4阴性样品制备天竺痫康宁胶囊制法中人工牛黄为细粉投料，取缺人工牛黄的处方量，依法制备阴性样品，

2.5专属性考察按“2.4”项下阴性样品。按“2.1”项下色谱条件测定，进样10 μL，测定，记录色谱图，结果在胆红素保留时间附近未见有色谱峰出现，表明天竺痫康宁胶囊中其他组份对测定无干扰，色谱图见图1。

A.胆红素对照品

B.天竺痫康宁胶囊样品(批号：130901)

C.阴性样品

2.6稳定性试验按“2.3”项下供试品溶液制备方法制备天竺痫康宁胶囊(批号：130901)供试品溶液1份，分别于0、4、8、12、16 h进行测定，供试品中胆红素含量的RSD为1.51%，结果表明供试品溶液在16 h内保持稳定。

2.7精密度试验吸取同一对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，进样6次，测得对照品溶液峰面积RSD为1.49%。

2.8重复性试验按“2.3”项下供试品溶液制备方法制备天竺痫康宁胶囊(批号：130901)6份，分别进样测定，测得胆红素含量RSD=1.67%(n=6)。结果测得平均值0.094 4 mg·g-1，表明该方法重复性良好。

2.9加样回收试验精密称取天竺痫康宁胶囊(批号：130901)1 g，加入浓度9.04 mg·L-1胆红素对照品溶液10 mL，按“2.3”项下供试品溶液制备方法制备。结果胆红素平均回收率为97.4%，RSD=2.02%(n=6)，结果见表1。

表1　加样回收试验测量结果(n=6)

2.10样品测定按供试液的制备及检测方法，测定3批天竺痫康宁胶囊(批号130901、130902、130903)中胆红素含量分别为0.095 3、0.091 4、0.093 8 mg·g-1。

3讨论

人工牛黄苦，凉，归肝，心经，清热解毒，息风止痉，化痰开窍，为天竺痫康宁胶囊臣药之一。天竺痫康宁胶囊药味众多，每味药处方量较小，因此有必要建立灵敏、简便、准确、重复性好的方法来控制制剂质量。胆红素的含量测定方法收载于历年中国药典，《中国药典》2015年版中使用紫外-可见分光光度法测定含量[2]。但紫外法测定易受其他药味影响[3]，在药物制剂质量标准研究工作中，许多含有人工牛黄的制剂使用HPLC法测定胆红素的含量作为控制制剂质量的手段之一[4-9]。在光照条件下，胆红素极易氧化[10]，但张东方等[11]研究表明，HPLC测定制剂中胆红素的含量，在避光的条件下，精密度、重复性及回收率可满足实验要求。笔者对文献[4-9,11]采用的流动相进行了摸索试验，结果甲醇-三氯甲烷-1%磷酸(80∶14∶6)的分离效果，且峰型好，满足分析方法要求，同时做了方法学摸索，结果提取方法超声(0.089 5 mg·g-1)>回流(0.074 3 mg·g-1)，提取溶剂三氯甲烷(0.094 1 mg·g-1)>流动相(0.013 8 mg·g-1)>甲醇(0.008 3 mg·g-1)，超声10、20 min结果相差不大，超声30 min胆红素含量稍低，提取剂量15 mL(0.098 2 mg·g-1)>25 mL(0.096 4 mg·g-1)>50 mL(0.073 7 mg·g-1)。考虑到供试品取样体积比较大，最终选择提取剂量25 mL。根据方法学考察结果，天竺痫康宁胶囊胆红素的提取以三氯甲烷25 mL作为提取剂，超声处理10 min。在“2.1色谱条件”下，考察了Intersil C18、Wondasil C18、Apollo C183根不同品牌填料的色谱柱对样品中胆红素峰含量影响，结果表明，理论塔板数均在2 000以上，表明该测定该方法测定胆红素，对色谱柱选择性不强，适用范围广。

参考文献

[1]陈永荣,张荣嘎,吴勇,等.HPLC法测定十味桂芪真武颗粒中芍药苷的含量[J].安徽医药,2014,18(12):2258-2260.

[2]国家药典委员会.中国药典(一部)[S].北京：中国医药科技出版社，2015：6.

[3]曹帅,夏晶,杨新华,等.3种牛黄及安宫牛黄丸中总胆红素含量测定方法的优化[J].药物分析杂志,2014,34(2):329-334.

[4]余翔,周红敏,徐晓兰,等.HPLC法测定常见感冒类制剂中胆红素的含量[J].绵阳师范学院学报,2011,30(2):54-56，60.

[5]李秋萍.HPLC法测定锡类散中胆红素的含量[J].安徽医药,2013,17(4):569-570.

[6]莎日娜,何春龙.HPLC法测定小儿清肺八味丸中胆红素的含量[J].中国药师,2014,17(3): 520-521.

[7]包保全,包长龙.HPLC法测定蒙成药宁心丸中胆红素的含量[J].中国民族民间医药,2014,23(13): 6，8.

[8]张秀兰,何春龙,李树明.HPLC法测定清热八味散中胆红素的含量[J].现代中药研究与实践,2014,28(2):60-62.

[9]周雪红,李志浩,李鹏.HPLC法测定西黄胶囊中胆红素的含量[J].中医药导报,2015,21(21):28-30.

[10] 邹秦文,石岩,刘薇,等.牛黄类药材各类成分定量检测方法研究概况[J].药物分析杂志,2015,35(1):8-15.

[11] 张东方,周美环，袁长季.光对胆红素稳定性的影响及其在桂蒲肾清片中的含量测定[J].天津中医药,2010,27(1):69-70.

Determination of bilirubin in Tianzhu Xiankangning capsules by HPLC

ZHANG Ying,SONG Zhi-zhao,LIU Yuan

(TheDivisionofTraditionalChineseMedicine,GuangxiInstituteofChineseMedicine&PharmaceuticalScienceGuangxiKeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicineQualityStandards,Nanning，Guangxi530022，China)

Abstract:ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of bilirubin in Tianzhu Xiankangning capsules.MethodsThe Intersil-C18column was used,and the mobile phase consisted of Methanol-trichloromethan-1% phosphoric acid (80∶14∶6) with the flow rate at 1.0 mL·min-1.The detection wave length was 450 nm and the sample size was 10 μL.ResultsLinearity of bilirubin was good around 2.26～45.2 mg·L-1，r=0.999 6.The average recovery was 97.4% with RSD less than 2.02% (n=6).ConclusionsThe method is sensitive,simple,accurate and repeatable,which can be applied to the determination of bilirubin in Tianzhu Xiankangning capsules.

Key words:Bilirubin/analysis;Chromatography,high pressure liquid;Concretio silicea bambusae;Arisaema cum bile;Drugs,chinese herbal

基金项目:广西壮族自治区卫生厅中医药科技专项(GZZJ14-11);南宁市科学研究与技术开发计划(20143135)

通信作者：刘元，女，主任药师，研究方向：中药药理与新药研制开发，E-mail:Liuyuan0821@vip.163.com

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.06.017

(收稿日期：2015-12-01，修回日期：2016-04-27)