一种基于农杆菌介导的拟南芥瞬时转化技术优化1)

郭勇　王玉成　王智博

(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨，150040)



一种基于农杆菌介导的拟南芥瞬时转化技术优化1)

郭勇王玉成王智博

(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨，150040)

摘要利用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)介导的拟南芥瞬时转化体系影响因素来确定最佳转化条件。以生长15日龄的拟南芥幼苗为试验材料，以转化pCAMBIA1301空载体的根癌农杆菌EHA105为目的菌株进行瞬时转化。研究了吐温20、菌液OD值、乙酰丁香酮(AS)及转化时间等对拟南芥瞬时转化效率的影响。结果表明：以体积分数为0.05%的吐温、菌液OD600值为1.0和120 μmol/L的AS侵染拟南芥2.5 h后，再共培养72 h，能够得到高瞬时转化效果。

关键词拟南芥；GUS基因；瞬时表达；实时定量；农杆菌介导转化

拟南芥是重要的模式植物，很多植物基因的功能都是通过基因转入拟南芥中进行研究，而转基因又分稳定表达与瞬时表达两种方式[1]，稳定表达需要的培养、鉴定时间较长，而与之相比，瞬时表达具有简单、快捷、周期短、准确等优点[2]，并且表达效率较稳定，转化率高。当需要在短时间内进行基因功能的分析或者蛋白间的互作以及蛋白与基因间互作等的研究时，瞬时表达的方法可作为一种高效的手段[3]。基于瞬时转化技术使基因在宿主体内瞬时表达，是一种快速的研究基因表达、蛋白质亚细胞定位及基因间互作的一种重要手段,与传统的转基因相比,瞬时表达不需要整合到染色体上，而且瞬时表达还不受基因的位置效应和基因沉默的影响，也不会产生可遗传的子代,生物安全性高[4]。因此,瞬时表达在启动子功能分析[5-6]、蛋白的表达[7-8]以及蛋白间的互作[9]，外源基因的表达[10-11]以及转基因互补[12-14]、蛋白质的亚细胞定位[15]、转录因子与顺式作用元件的互作[16]等分子生物学的研究中得以广泛应用，而这些研究都是建立在一个稳定、高效的瞬时转化系统的基础之上的。由于基因枪等方法需要基因枪等贵重仪器，而且在某些植物瞬时表达时就转基因表达的稳定性而言,农杆菌转化法比基因枪法具有更大的优势。前人对瞬时表达的研究多致力于烟草等植物，吴英杰等[17]找到了适宜于烟草瞬时转化的优良方法，而人们对拟南芥的瞬时转化的研究则相对较少。Mcintosh K B et al.[18]通过真空渗透的方法发现农杆菌侵染5 d比侵染3 d的幼苗中基因的表达水平高，Silvina Mangano et al.[19]通过农杆菌渗透拟南芥叶片，使含有AS和缺素的培养基长时间浸泡叶片而提高农杆菌侵入能力，从而提高了转化效率。在前人研究的基础上，本研究中以拟南芥为材料,采用农杆菌介导转化法，通过观察和分析含β-葡糖醛酸酶基因(GUS基因)的pCAMBIA 1301在拟南芥中的表达情况来探索和优化拟南芥高效瞬时表达的条件。

1材料与方法

拟南芥野生型苗为哥伦比亚型,由林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)保存。将植物表达载体pCAMBIA1301利用电转法转入根癌农杆菌EHA105菌株。拟南芥的转化基本培养基以1/2MS培养基为基础培养基，温室的相对湿度为60%～75%，光照强度为100 μmol·m-2·s-1，光周期为16 h光照，8 h黑暗，温度为22 ℃。

1.1菌液的制备及转化条件

挑取农杆菌单菌落在10 mL的LB液体培养基中28 ℃培养过夜，次日上午将该菌液用新鲜LB稀释至OD值0.1左右，然后再进行培养，待菌液至OD600为0.6～0.7时，3 000 r/min离心10 min收集菌体，用于拟南芥的瞬时侵染。

分别设置如下不同处理:

(1)以侵染培养基(1/2MS+120 μmol/L AS+2%蔗糖+270 mmol/L甘露醇+1.5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+0.02%吐温,pH=5.4)为基本培养基，设置农杆菌侵染的OD600分别为0.4、0.6、0.8、1.0、1.2。

(2)以侵染培养基(1/2MS+120 μmol/L AS+2%蔗糖+270 mmol/L甘露醇+1.5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+0.8 OD农杆菌,pH=5.4)为基本培养基，最终吐温20体积占侵染液体积的比例分别为0.01%、0.02%、0.03%、0.05%。

(3)以侵染培养基(1/2MS+120 μmol/L AS+2%蔗糖+270 mmol/L甘露醇+1.5 mg/LKT+0.5 mg/L NAA+0.02%吐温+0.8 OD农杆菌,pH=5.4)为基本培养基，As的终浓度分别设置为0、60、120、180 μmol/L。

1.2瞬时转化

先将拟南芥置于蔗糖质量分数为25%的1/4MS高渗溶液中25 ℃下浸泡15 min,然后将经高渗处理的拟南芥浸泡在不同菌液OD值的侵染液中，25 ℃ 120 r/min培养2.5 h，然后取出，用500 mmol/L的甘露醇洗3 min，再用无菌滤纸吸干叶片表面的液体,置于共培养培养基(1/2MS+120 μmol/L AS+1.5 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+3%蔗糖，pH=5.4)上，放在(23±2)℃培养条件下培养72 h，然后进行GUS染色分析和实时定量PCR测定，每个试验3次重复。

1.3GUS染色

X-GLUC染色液配制(100 mL):200 mmol/L的pH=7.0的磷酸缓冲液50 mL；100 mmol/L的Na2EDTA溶液10 mL；5 mmol/L的K3[Fe(CN)6]10 mL；5 mmol/L的K4[Fe(CN)6]10 mL；0.1% Triton-100；X-GLUC 60 mg,然后加水定容至100 mL。

待转化72 h后，将侵染处理后的拟南芥苗放入50 mL离心管中，各加入10 mL的GUS染色液浸没植株，37 ℃恒温黑暗中染色过夜，再用V(乙醇)∶V(乙酸)=3∶1的脱色液脱色约1 h，其间适时更换脱色液，然后取出观察染色结果。

1.4实时定量RT-PCR

总RNA的提取:经与1.2同样的处理，共培养72 h后，取出各组处理苗，无菌水洗净后用液氮冻起来作为下一步提取总RNA的材料。拟南芥总RNA的提取采用CTAB法。

总RNA反转录：上一步提取的RNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，再用紫外分光光度计检测RNA浓度与纯度并进行反转录。

反转录反应体系：Anchored Oligo(dT)18(0.5 g/L)1 μL、2×TS Reaction Mix 10 μL、transcript RT/RI Enzyme Mix 1 μL;Gdna Remover 1 μL;总RNA 1 μg、加无RNase的水到体积20 μL。反应程序：42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 s。将反转录产物稀释10倍，用作定量PCR模板。

实时定量PCR：分别以上述植物材料提取的cDNA为模板，进行实时定量PCR扩增，检测瞬时转化入拟南芥的GUS基因的表达情况，并用α-tubulin基因表达量的平均值作为内参(所有样品都进行3次生物学重复)。基因引物序和内参引物序列如下。

基因引物GUS-F：GTCGCGCAAGACTGTAACCA；GUS-R：TGGTTAATCAGGAACTGTTG。内参引物为α-tubulin-F：GATGTACCGTGGTGATGTC和α-tubulin-R：GAGCCTCTGAAAATTCTCC。实时定量PCR反应程序：94 ℃预变性30 s；94 ℃ 12 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，80 ℃读板1 s，共45个循环。

2结果与分析

2.1不同农杆菌OD值对瞬时转化效率的影响

农杆菌OD值及侵染时间是影响遗传转化率的重要因子[20]。因此，用不同的农杆菌侵染浓度，通过GUS染色和定量PCR来研究转化的GUS基因在宿主中的表达情况。GUS染色和定量PCR结果表明，不同农杆菌OD值对转化效率影响明显。当农杆菌侵染OD600值为1.2时，拟南芥GUS染色最浅(图1)，GUS基因的表达量也最低，说明该菌液OD值条件下拟南芥的瞬时转化效率最低。而农杆菌侵染OD600值为0.4时，GUS的染色和定量PCR结果都显示其瞬时转化效率较低(图1)；当侵染OD600值为0.8和1.0时，GUS染色和定量PCR都显示瞬时转化效率明显提高，定量PCR结果显示，当侵染OD值为1.0时，瞬时转化效率最高(表1)。

图1　不同OD值农杆菌对瞬时转化拟南芥的GUS染色

农杆菌OD值GUS基因相对表达量0.45.3990.814.2891.016.9101.21.000

2.2不同乙酰丁香酮(AS)浓度对拟南芥瞬时转化效率的影响

我们对不同浓度AS对拟南芥瞬时转化效率的影响进行了研究。如图2所示，当AS浓度为0时，拟南芥的GUS染色颜色最浅，仅有少量叶片染上色，定量PCR结果表明，其GUS基因的相对表达量也最低(表2)，说明其瞬时转化效率最低。随着AS的浓度上升，GUS染色和定量PCR结果都表明其瞬时转化效率在升高，在120 μmol/L时，瞬时转化效率最高，当AS为180 μmol/L时，转化效率下降(图2，表2)。说明，瞬时转化的最佳AS浓度为120 μmol/L,与烟草的最适AS浓度接近[17]。

1～4.AS浓度分别为0、60、120、180 μmol/L的GUS基因的染色情况。

AS浓度/μmol·L-1GUS基因相对表达量 01.000605.82712013.98718011.002

2.3不同体积分数吐温对瞬时转化效率的影响

本研究对不同体积分数的吐温对拟南芥瞬时转化效率的影响进行了研究。结果如图3、表3所示，当吐温体积分数在0.01%时，拟南芥GUS的染色最浅，且仅有少量叶片染上色，当吐温体积分数升高时，GUS的染色加深，基因表达量也持续升高，当吐温体积分数在0.05%时，GUS染色的蓝色最深，大部分叶片为深蓝色，并且基因的相对表达量也最高，与染色结果相一致。因此，吐温体积分数为0.05%时为最佳的转化浓度。

1～4分别为吐温体积分数为0.01%、0.02%、0.03%、0.05%时对转基因拟南芥的GUS染色情况。

表3不同体积分数的吐温对转基因拟南芥的GUS基因的表达情况

吐温体积分数/%GUS基因相对表达量0.011.0000.023.8210.0323.6160.0557.348

2.4各种最优条件下瞬时转化的效率研究

上述各组试验结果得出的最适吐温体积分数0.05%、乙酰丁香酮120 μmol·L-1和菌液OD600值1.0，在各组的处理中GUS染色最深，基因的表达量也最高。为了进一步的验证，我们又以体积分数0.05%的吐温、OD600值为1.0的菌液OD值和120 μmol/L AS的处理作了同样的瞬时表达试验，结果如图4和表4所示，该组合处理的拟南芥GUS染色最深，基因的表达量也最高，瞬时转化效率最高。

1为农杆菌OD值0.8，AS浓度120 μmol/L,吐温体积分数0.05%；2为农杆菌OD值0.8，AS浓度120 μmol/L,吐温体积分数0.02%；3为农杆菌OD值1.0，AS浓度120 μmol/L,吐温体积分数0.02%；4为农杆菌OD值1.0，AS浓度120 μmol/L,吐温体积分数0.05%。

图4.不同组合处理对转基因拟南芥的GUS染色影响

3结论与讨论

本研究通过GUS染色和检测GUS基因表达来研究瞬时转化的效率,并比较单一因素对拟南芥瞬时转化效率的影响，进而对根癌农杆菌介导的拟南芥瞬时转化方法作进一步的优化。在瞬时转化过程中用于侵染的菌液OD600值、AS浓度和吐温的体积分数都对瞬时转化效率产生明显影响，说明这些因素的优化对瞬时转化效率的提高至关重要。根癌农杆菌作为瞬时侵染的媒介，菌液的浓度直接决定了转化效率的高低，当菌液OD值过低时，携带目的基因的农杆菌进入植物细胞的数量会很低，目的基因的表达量也会较低，因此菌液OD600值太低的侵染液转化效率也相应的低，而当菌OD值过高时，则会对植物体造成伤害，反而使转化效率降低。在一定的浓度范围内，乙酰丁香酮(AS)可诱导农杆菌体内基因活化，从而促进外源基因的整合，而提高瞬时转化效率，但当其浓度过高时，也会影响植物细胞渗透调节，对细胞造成胁迫而使转化效率降低。吐温作为一种渗透剂，有助于根癌农杆菌侵入植物组织中，从而一定程度上提高基因的转化效率。高体积分数的吐温有助于提高转化效率，但也对外植体产生明显的伤害，使外植体在浸泡过程中萎蔫。在试验的过程中，由于拟南芥这种植物比较脆弱，当采用高体积分数(体积分数为0.06%及以上)的吐温时，会导致拟南芥在侵染或者在固体培养基中培养的过程中萎焉或死亡，而当吐温体积分数为0.05%时，拟南芥的瞬时转化效率已经非常高，能够满足试验对瞬时转化效率的要求，故吐温体积分数不宜过高。

拟南芥作为一种模式植物，在分子生物学研究中具有重要地位，但目前拟南芥主要是通过浸花法进行的稳定转化，而对其瞬时转化的研究较少。瞬时转化具有时间短，表达效率高等优点，广泛应用于蛋白的亚细胞定位[15]，蛋白与蛋白间互作[9]，蛋白与DNA间的互作、目的蛋白的表达与制备[7-8]等。因此，本研究为以拟南芥为宿主的这些研究奠定了基础。

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Optimizing Transient Genetic Transformation Method onArabidopsisPlants Mediated byAgrobacteriumtumefaciens

Guo Yong, Wang Yucheng, Wang Zhibo

(State Key Laboratory of Forest Genetics and Tree Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(6)：41-44，83.

We studied the optimal transformation conditions for transient genetic transformation ofArabidopsismediated byAgrobacteriumtumefaciens. We transformed Agrobacterium EHA105 carrying an empty pCAMBIA1301 into the 15-day Arabidopsis plants for genetic transformation research. We studied the effects on transient expression including the concentration of theAgrobacterium, Tween-20, and acetosyringone (AS), and transformed time. Under the conditions of 1.0 OD ofAgrobacterium, 0.05% of Tween-20, 120 μmol/L of AS, transformed for 2.5 hours, and co-cultured for 3 days, the transient transformation efficiency is highest.

KeywordsArabidopsisthaliana;GUSgene; Transient expression; Real-time quantitative;Agrobacteriummediated transformation

第一作者简介：郭勇，男，1990年2月生，林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，硕士研究生。E-mail：feiyongzhe123656@163.com。 通信作者：王玉成,林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，教授。E-mail：wangyucheng1029@126.com。

收稿日期：2015年12月7日。

分类号Q786

1)哈尔滨市科技创新人才研究专项资金(优秀学科带头人)项目(2012RFXXN023)。

责任编辑：潘华。