柴胡皂苷d联合黄芩苷对大鼠脑缺血/再灌注损伤中PARP-1表达的影响*

董利平　崔玉环　赵宝民　连晶晶　魏玉磊　颜　娟　郑茂东　刘占矿

河北北方学院附属第一医院(张家口 075000)



柴胡皂苷d联合黄芩苷对大鼠脑缺血/再灌注损伤中PARP-1表达的影响*

董利平崔玉环赵宝民连晶晶魏玉磊颜娟郑茂东刘占矿△

河北北方学院附属第一医院(张家口 075000)

摘要目的：探讨柴胡皂苷d联合黄芩苷对二磷酸腺苷核糖多聚酶-1(Poly(ADP-ribose)polymerase-1，PARP-1)表达的影响。方法：将健康雄性SD大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组、PARP-1抑制剂PJ34组、柴胡皂苷d组、黄芩苷组、柴胡皂苷d+黄芩苷组，按再灌注时间点不同分为6h、12h、24h、48h、72h五个亚组；应用修饰酶循环法检测NAD+浓度，定量RT-PCR技术检测PARP-1 mRNA表达。结果：模型组NAD+浓度较假手术组明显降低(P<0.01)，PARP mRNA表达显著增加(P<0.01)，于再灌注24 h达高峰；药物干预组NAD+浓度较模型组显著增加(P<0.01)，PARP mRNA表达显著降低(P<0.01)，并于24h表达最低(P<0.01，P<0.05)，且柴胡皂苷d+黄芩苷组效果最为显著(P<0.01)。结论：我们推测柴胡皂苷d联合黄芩苷可能是通过抑制MCAO大鼠PARP-1表达，降低NAD+消耗，实现其对大鼠脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用。

主题词脑缺血/中医药疗法动物，实验大鼠

脑缺血/再灌注损伤中PARP-1过度激活可导致NAD+大量耗竭、ATP减少，最终细胞能量耗竭，细胞死亡[1]。文献报道早期给予PARP-1抑制剂可阻断PARP-1酶活性，减轻缺血/再灌注中神经元的损伤[2]。因此本研究选取柴胡皂苷d和黄芩苷，通过建立大鼠脑缺血/再灌注损伤模型，检测药物对脑缺血/再灌注病灶中PARP-1及NAD+的表达情况，探讨其在脑缺血/再灌注损伤中的神经保护机制。

1材料与方法

1.1实验动物与分组SD(Sprague-Dawley)大鼠420只，健康雄性，体质量(240±5)g，购自北京大学实验动物科学部，随机将大鼠分成正常组、假手术组、模型组、PARP-1抑制剂PJ34组、柴胡皂苷d组、黄芩苷组、柴胡皂苷d+黄芩苷组7组，每组60只，按再灌注时间点不同分为6h、12h、24h、48h、72h五个亚组。

1.2药物与试剂PARP-1抑制剂PJ34(美国Santa Cruz公司)；柴胡皂苷d(Sigma-Aldrich公司)；黄芩苷(Sigma-Aldrich公司)；栓线(北京沙东生物技术有限公司)，试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；NAD+浓度检测酶循环法检测试剂盒(Sigma-Aldrich公司)；Trizol裂解液(Invitrogen 公司)；实时荧光定量PCR试(Fermentas公司)；PARP-1聚合体蛋白一抗(北京博奥森公司)。

1.3制备脑缺血/再灌注损伤大鼠模型大鼠称重，腹腔注射麻醉7%水合氯醛(5mL·kg-1)，采用改进Longa线栓法，右侧颈外动脉暴露并剪开，推栓线至大脑中动脉开口处，阻断其血流，导致脑缺血，固定栓线，2h后拉出栓线，恢复血液供应，完成脑缺血再灌注损伤模型；假手术组不实施缺血再灌注只进行手术。

1.4用药方法脑缺血/再灌注手术后2h 腹腔注射药物：PJ34组(25mg·kg-1)、柴胡皂苷d组(70mg·kg-1)、黄芩苷组(30mg·kg-1)、柴胡皂苷d(70mg·kg-1)+黄芩苷(30mg·kg-1)组；正常对照组、假手术组及模型组腹腔注射等量生理盐水；各组均每天早晨给药1次。

1.5神经功能损伤评分Longa评分标准于动物清醒后进行评分：0分：行为正常；1分：对侧前爪伸展不充分，轻微不对称；2分：行走时向外侧转圈；3分：行走时向对侧倾斜，颤抖不稳、跌倒；4分：不能行走，意识丧失；符合1-3分者大鼠纳入实验，其余剔除。

1.6修饰酶循环法检测病灶中NAD+浓度将脑缺血/再灌注病灶组织分别置HEPES-NaOH液中研磨，将匀浆4℃15000r·rain-1离心20min，上清液即为组织总蛋白溶解液。组织总蛋白溶解液中NAD+浓度检测按酶循环法检测试剂盒内附说明书操作。

1.7定量RT-PCR方法检测病灶中PARP-1 mRNA表达严格按照Trizol试剂盒说明书提取各组脑组织总RNA，测定总RNA量以及其纯度，逆转录合成cDNA后，放置于-20℃备测。PARP-1的上游引物5′-CCCAGGGTCTTCGGATAG-3′，下游引物5′-AGCGTGCTTCAGTTCATACA-3′，扩增片段长度为185bp；β-actin的上游引物5′-TCCGTGGAGAAGAGCTACGA-3′，下游引物5′-GTACTTGCGCTCAGAAGGAG-3′，扩增片段长度为309bp，以β-actin为内参对照。25μL反应体系为：SYBR Green Mix 12.5μL，上下游引物各1.0μL(5μmol/L)，ROX 0.5 μL，cDNA 1.0μL及9.0μL ddH2O；反应条件：95℃变性10min，然后按95℃×30s，55℃×1min，72℃×42s，进行40个循环，对结果进行分析。

1.8统计学方法数据分析釆用SPSS13.0统计软件，数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验，P<0.05为有统计学差异。

2结果

2.1神经功能行为学评分与模型组相比，药物干预组神经功能行为学评分有统计学意义(P<0.01)，柴胡皂苷d+黄芩苷组效果最为显著(P<0.01)。见表1。

2.2脑组织NAD+浓度水平与正常组及假手术组相比，模型组NAD+浓度下降(P<0.01)；与模型组相比，药物干预组则浓度增加(P<0.01，P<0.05)，且柴胡皂苷d+黄芩苷组效果最为显著(P<0.01)。见表2。

表1　脑缺血/再灌注后不同时间神经功能行为学评分(n=6)

注：▲P< 0. 01，与假手术组和正常对照组比较；△P< 0. 01，◇P< 0. 05，与模型组各对应时间点比较；◆P<0. 01，与PJ34组各对应时间点比较

表2　脑缺血/再灌注后不同时间脑组织的NAD+浓度(mg·g-1wet tissue，n=6)

注：▲P< 0. 01，与假手术组和正常对照组比较；△P< 0. 01，◇P< 0. 05，与模型组各对应时间点比较；◆P<0. 01，与PJ34组各对应时间点比较

2.3PARP-1 mRNA的表达情况与正常组及假手术组相比，模型组PARP mRNA表达增加(P<0.01)；并随缺血/再灌注时间延长呈动态变化，于24h时达最高峰，给予药物干预后PARP mRNA表达降低，并于24h表达最低(P<0.01，P<0.05)，且柴胡皂苷d+黄芩苷组效果最为显著(P<0.01)；而正常对照组和假手术组均无明显变化。见表3。

表3　脑缺血/再灌注后不同时间脑组织的PARP-1 mRNA表达(%，n=6)

注：▲P< 0. 01，与假手术组和正常对照组比较；△P< 0. 01，◇P< 0. 05，与模型组各对应时间点比较；◆P<0. 01，□P<0. 05，与PJ34组各对应时间点比较

3讨论

PARP-1作为结合蛋白酶，其生物学效应包括识别及结合DNA缺口，修复损伤DNA，保证基因组完整性，进而催化多聚ADP核糖化，转送NAD+核糖至受体蛋白，形成核糖链，通过改变受体蛋白结构，而影响受体蛋白生物学活性。目前有大量证据表明 PARP-1在脑缺血/再灌注损伤发展过程中起重要作用。Kauppinen等人[3]在大鼠双侧颈动脉结扎再灌注治疗中发现，PARP-1抑制剂PJ34可抑制肿瘤坏死因子表达及小胶质细胞激活和星形胶质细胞增生，证实其可通过减少炎症，增强缺血后神经元的存活和再生长期；短暂性大脑中动脉梗塞的动物模型(MCAO)中，PARP-1小鼠较野生型基因小鼠的梗塞面积明显减小，将野生型PARP-1小鼠基因再转移至PARP-1小鼠后其保护缺血/再灌注的作用消失[4]，证实梗塞面积的减小是因PARP-1基因缺陷所致，给予PARP-1抑制剂后梗塞面积亦减小，PARP-1缺陷在脑缺血/再灌注中的保护作用被多种酶抑制剂所重复，包括苯酰胺类、异喹啉酮化合物、phenanthridinones及多种经典PARP-1抑制剂[5]，充分证实PARP途径在脑梗塞损伤中的病生理过程中的重要性，及PARP-1抑制剂的神经保护作用。

柴胡皂苷d是柴胡主要有效成分，具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗肿瘤，调解免疫及内分泌系统，抑制NF-κB、NF-AT激活的T淋巴细胞和AP-1信号对抗增殖作用[6]。黄芩的主要活性成分黄芩苷，具有抗凋亡、抗炎、免疫调节的作用[7]。

本研究结果表明大鼠短暂局灶性脑缺血/再灌注后缺血脑组织中PARP-1 mRNA表达明显增加，NAD+过度消耗，而给予PARP-1抑制剂PJ34及柴胡皂苷d+黄芩苷干预后，PARP-1 mRNA表达明显减少，二者统计学上无差异，证实柴胡皂苷d及黄芩苷同时给药可减轻脑梗塞的缺血/再灌注损伤，其机制可能与其抑制PARP-1表达、NAD+消耗减少有关。为拓宽柴胡皂苷d联合黄芩苷在脑缺血/再灌注中的临床应用提供了理论依据。

参考文献

[1]Ma Y， Nie H， Chen H， Li J， et al. NAD(+)/NADH metabolism and NAD(+)-depen- dent enzymes in cell deathand ischemic brain injury： current advances and therapeutic implications[J]. Curr Med Chem. 2015， 22(10)： 1239-47.

[2]Zhang R， Tang S， Huang W， et al. Protection of the brain following cerebral ischemia through the attenuation of PARP-1-induced neurovascular unit damage in rats[J]. Brain Res. 2015，93(15)：552-553.

[3]Kauppinen TM， Suh SW， Berman AE， et al. inhibition of poly(adp-ribose) polymerase suppresses inflammation and promotes recovery after ischemic injury[J]. J Cereb Blood Flow Metab. 2009， 29(4)： 820-9.

[4]Goto S， Xue R， Sugo N， et al. Poly(ADP-ribose) merase impairs early and long-term experimental stroke recovery[J]. Stroke，2002， 33： 1101-1106.

[5]F Moroni， A Cozzi， A Chiarugi， L Formentini， et al. Long-lasting neuroprotection and neurological improvement in stroke models with new， potent and brain permeable inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase[J]. British Journal of Pharmacology，2012， 165： 1487-1500.

[6]Wong VK， Zhang MM， Zhou H， et al. saikosaponin-d enhances the anticancer potency of tnf-alpha viaovercoming its undesirable response of activating nf-kappa bsignalling in cancer cells[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2013， 2013： 745295.

[7]Lee W， Ku SK， Bae JS， et al. Anti-inflammatory effects of Baicalin， Baicalein， and Wogonin in vitro and in vivo[J]. Inflammation，2015， 38(1)： 110-125.

(收稿2016-01-08；修回2016-02-21)

通讯作者△

【中图分类号】R743.31

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7369.2016.07.082

*河北省卫计委科研基金项目(ZL20140035)