温胆汤对焦虑性失眠大鼠即刻早期基因表达的影响*

张　慧　冯卫星　张焕超

陕西中医药大学附属医院脑病科 (咸阳 712000)



温胆汤对焦虑性失眠大鼠即刻早期基因表达的影响*

张慧冯卫星张焕超△

陕西中医药大学附属医院脑病科 (咸阳 712000)

摘要目的: 观察温胆汤对焦虑性失眠大鼠脑皮层和海马部位c-fos和c-jun的影响。方法: 健康SD大鼠90只,随机分为正常组、空白模型组、西药组及中药大、中、小剂量组,每组各15只。空白模型组、西药组和中药组分别给予蒸馏水、地西泮和温胆汤煎剂灌胃。空白模型组、西药组、中药大中小剂量组接受不确定性空瓶饮水刺激并采用对氯苯丙氨酸腹腔注射建立焦虑性失眠模型,并行行为学测试。末次测试24h后,用免疫组化法测大鼠海马区c-fos及c-jun含量。结果:西药组及中药大中小剂量组失眠大鼠的焦虑行为较空白模型组减少；中药大中小剂量组大鼠海马区c-fos和c-jun含量较空白模型组降低 (P<0.05)。结论: 温胆汤大中小剂量同地西泮均具有一定的抗焦虑作用，c-fos和c-jun 基因很可能参与了焦虑性失眠大鼠细胞凋亡过程，温胆汤可能是通过抑制脑组织c-fos 和c-jun的表达上调，而发挥脑保护作用。

主题词失眠/中医药疗法温胆汤即刻早期基因大鼠实验，动物

焦虑障碍是最常见的精神障碍，失眠常伴随出现，约1/3的焦虑障碍患者常以失眠为主诉就诊[1]。焦虑所引起的失眠可能会影响患者生活质量及工作能力，加重患者经济负担[2]。温胆汤为治疗痰热内扰型失眠的传统方剂，前期临床试验研究证实其治疗焦虑性失眠安全有效。本研究从即刻早期基因表达探讨温胆汤治疗“痰热内扰”型焦虑性失眠的分子机制，能加深对温胆汤方证的系统了解，揭示其深层次作用机制。

1材料和方法

1. 1实验动物由第四军医大学动物实验中心提供清洁级雌性SD大鼠90只,体重180±50g, 许可证号SCXK (陕) 2013-002。

1.2药物与试剂温胆汤原方组成药物加8倍水浸泡30min,煎煮2次,每次40min, 合并滤液, 浓缩成1∶1药液, 4℃冰箱保存备用,临用时用蒸馏水配成40%溶液。全部药材购自陕西中医药大学附属医院中药房。舒乐安定片( 北京益民药业有限公司生产，批号131003)。对氯苯丙氨酸(美国Sigma公司生产),临用前将对氯苯丙氨酸与弱碱性生理盐水以45mg/100g比例配置成混悬液备用。

1.3动物分组与给药大鼠按随机数字法随机分为正常组、空白模型组、西药组和中药大、中、小剂量组,每组各15 只。除正常组外，其余五组均采用单笼饲养且接受不确定性空瓶饮水刺激建立焦虑应激模型。在第6、7日早上8:00开始，按1mL/100g腹腔注射对氯苯丙氨酸，连用两天，复制大鼠失眠模型。应激结束后各组交叉进行EPM行为学测试。大鼠出现昼夜节律消失, 白天也活动不停, 表明模型复制成功。空瓶刺激1周后空白模型组即给予蒸馏水灌胃，西药组给予地西泮(0.5mg/kg)灌胃，中药大、中、小剂量组分别给予温胆汤(2 mL/ 100g、1 mL/ 100g 、0.5mL/ 100g)灌胃，上述治疗连续应用7d。正常组不做任何处理，自由摄食及饮水。

1. 4实验方法

1.4.1 行为学观察：行为学观察包括攻击、探究及修饰行为。即观察大鼠空瓶应激10min，每分钟记录一次，每只大鼠只要出现攻击、探究或修饰行为中任一行为即记为1，未出现上述三种行为则记为0。由两名观察者同时记录，取两人观察结果的平均值。

1.4.2 高架十字迷宫(Elevated plus-maze test,EPM)行为学测试：采用高架十字迷宫检测大鼠焦虑状态。高架十字迷宫由两个开臂(开臂A和开臂B)及两个闭臂(闭臂A和闭臂B)组成。测试前一星期，每天抚摸实验大鼠1～5min，连续7d，以消除实验大鼠对实验者的恐惧。迷宫测试前将大鼠单独放入100cm×100cm×40cm塑料盒中自由探究 5min。随后迅速将实验大鼠放入迷宫中央区，头朝开臂A，释放同时开启摄像监控器记录5min内大鼠下述指标：①开臂进入次数(OE)：指进入任何1个开放臂的次数，大鼠4个爪子均进入到臂内为进入开始，以单爪从该臂中完全退出为进入完成；②闭臂进入次数(CE)：即进入任何1个封闭臂的次数，以大鼠4个爪子均进入到臂内为准；③开臂滞留时间(OT)，以秒为单位计算；④闭臂滞留时间(CT)，以秒为单位计算。由①～④分别计算出:①开臂进入次数百分比(OE%)，即开臂进入次数/(开臂进入次数+闭臂进入次数)×100%；②开臂滞留时间百分比(OT%)，即开臂滞留时间/(开臂滞留时间+闭臂滞留时间)×100%。记录结束后清理迷宫，并用75%酒精擦拭，以消除前一实验大鼠气味对下一实验大鼠的影响。

1.4.3 c-fos和c-jun阳性细胞计数：末次测试24h后处死，断头取脑，置于4%多聚甲醛的磷酸缓冲液(pH7.4)，固定7h后，-20℃恒冷箱切片。蒸馏水冲洗，0.01mol/LPBS浸泡5min，循环2次，0.3H2O2-PBS液中漂洗15 min，后加5%山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育20 min。除去血清，再滴加兔抗多克隆fos抗体和兔抗多克隆jun抗体，其混合物在37℃环境下孵育2 h；蒸馏水冲洗，0.01mol/L PBS浸泡5min，共3次，37℃环境下加入生物素化羊抗兔IgG (1∶150)孵育1 h，蒸馏水冲洗，0.01mol/L PBS浸泡5min，共3次，再入SABC复合物中孵育1h(37℃)。蒸馏水冲洗，0.01mol/LPBS浸泡5min，循环3次，DAB显色5min，重蒸水终止染色10min，脱水、透明后封片备检。每只大鼠脑海马及皮层区各选3张切片，应用10×10倍显微镜观察5个视野的c-fos和c-jun阳性细胞并计数。取同一区域同一视野相同面积内阳性细胞数的平均值进行统计学分析。

1.5统计学方法采用SPSS17.0进行单因素方差分析。

2结果

2.1温胆汤对大鼠行为学的影响空白模型组、中药大中小剂量组及西药组大鼠行为学测试中，入臂总次数较正常组增高。中药大、中剂量组及西药组开臂入臂次数百分比及开臂滞留时间百分比较空白模型组升高。具体数据见表1。

表1　实验大鼠行为学测试结果

2.2温胆汤对大鼠脑内c-fos、c-jun水平的影响空白模型组及药物干预各组大鼠脑内的c-fos、c-jun细胞数较正常组明显增多(P<0.05),推测c-fos、c-jun水平升高可能与该类失眠的发生相关,地西泮组及温胆汤大、中、小剂量组大鼠大脑内c-fos和c-jun细胞数均有不同程度减少(P<0.05)。其中温胆汤大、中剂量组失眠大鼠大脑内c-fos和c-jun细胞数较温胆汤小剂量组减少明显。

表2　c-fos细胞数( 10×10, 0.01mm2)

注:△表示与正常组比较,P<0.01；▲表示与空白模型组比较,P<0.05

表3　c-jun细胞数(10×10, 0.01mm2)

注:△表示与正常组比较,P<0.01；▲表示与空白模型组比较,P<0.05。

3讨论

睡眠过程是人体正常工作所必须的生理现象，尤其对大脑学习、记忆功能有极大的辅助功能。紧张、焦虑、失眠会严重影响患者的生活质量。严重的睡眠障碍可能会产生反应迟钝、思维混乱、注意力不集中、定向力、计算力及记忆力下降等一系列中枢神经受损症状。剥夺睡眠24h即可使人的认知能力下降30%～40%。若剥夺睡眠48h人的认知能力可下降60%～70%[3-4]。现代化生活节奏不断加快，生活压力不断增加，导致人群中焦虑性失眠患者与日俱增。《素问·逆调论》有云：“胃不和则卧不安”。即指脾胃不和，痰湿内生，食滞内扰，从而不得眠。“心为君火，肝为相火，君火不宁，相火易动。”怒易伤肝，引起相火妄动，心火不宁，挟痰上行，导致痰热内扰，故而失眠。徐东皋云：“痰火扰乱，心神不宁，思虑过伤，火炽痰郁而致不眠者多矣。”

温胆汤是古今临床常用方剂，药味较少，平淡无奇，然其配伍精当，标本同治，因其可调胆和胃，理气化痰，健脾安神，故为治疗痰热内扰型失眠的主要方剂。《三因极一病证方论》卷九中记载温胆汤主治胆胃不和、痰热内扰而致的虚烦不得眠。患者常常表现为心烦不寐，触事易惊，或夜多异梦，眩悸呕恶或癫痫。方中君药半夏，性辛温，燥湿化痰，降逆和胃。臣药竹茹可清化痰热，除烦止呕，药甘微寒，可解少阳腑热。半夏加竹茹，既能化痰浊，又能清胆热，使得胆气清肃，胃气顺降，胆胃相和，恶呕可止。枳实，辛苦微寒，可破气消痰，痰随气下，有通痞塞之功。陈皮燥湿化痰，辛苦而温，既可以辅半夏祛痰之功，亦能健脾，强枳实行气之效。如《本草纲目果部》卷三十记载:“橘皮，苦能泄而燥，辛能散，温能和。其治百病，总是取其理气燥湿之功。同补药则补，同泻药则泻，同升药则升，同降药则降。脾乃元气之母，肺乃摄气之篱，故橘皮为二经气分之药，但随所配而补泻升降也。”内扰之痰，邪本在湿，脏本在脾。方中茯苓通过健脾渗湿而杜生痰之源。甘草为使，益脾和中，调和诸药。加生姜以煎之，既助半夏竹茹祛痰止呕，又解半夏之毒；大枣与甘草、茯苓为伍，健脾补土以治湿，与生姜相配，能调和脾胃，中州健运，诸药相合，化痰而不过燥，清热而不过寒，痰热得化，胆热得清，胃气和降。诸要共奏理气化痰，清胆和胃之效。前期临床研究表明，焦虑性失眠就诊患者中，痰热内扰证占72.1%。温胆汤为治疗痰热内扰型失眠症的主要方剂，能有效缓解患者焦虑症状，改善睡眠质量。

大鼠喜欢探究新环境,但不喜爱强光及在开阔地活动。EPM通过观察大鼠对新环境的探究行为及对高悬着开臂的恐惧行为的矛盾状态，来评价药物的抗焦虑或致焦虑作用。在本实验中，温胆汤可以增加大鼠对开臂的偏爱(即增加进入开臂的次数和在开臂内滞留的时间)，却不改变入臂总次数和入臂总时间，也即开臂进入次数百分比和开臂滞留时间百分比升高，则认为该药具有抗焦虑的作用。

即刻早期基因c-fos、c-jun，为核内蛋白类细胞癌基因，脑功能区神经元及神经胶质细胞接受刺激后可诱导相应区域细胞的c-fos、c-jun 原癌基因短暂快速表达[5]。即刻早期基因参与细胞分裂、生长分化、信息识别与传递，与学习、清醒剂记忆等生理活动密切相关[6]。原癌基因c-fos 表达的核磷蛋白( Fos)作为核内第三信使，在外界刺激与转录偶联的信息传导过程中发挥重要作用[7]。正常情况下, 神经细胞中c-fos、c-jun蛋白仅有低水平表达；一旦出现焦虑、失眠等外源性刺激, c-fos与Fos形成的二聚体作用于AP-1位点激活迟反应基因(LRG)，其表达产物可促使GABA释放减少、谷氨酸释放增加等，从而改变神经网络的兴奋性。神经网络的兴奋抑制失衡从而形成失眠[8-9]。多个实验数据表明，c-fos蛋白的表达程度越高，因失眠所导致的神经突触越活跃[10]。本实验结果提示，温胆汤可使焦虑性失眠大鼠皮层及海马区的c-fos 和c-jun蛋白表达降低,阳性细胞数减少。它可能通过降低脑内c-fos、c-jun表达水平、减少大脑神经细胞凋亡而对焦虑性失眠大鼠起到脑保护作用。结合温胆汤的促眠实验以及检测学习记忆能力的Morris水迷宫实验结果，均表明温胆汤可改善睡眠质量、具有脑保护作用。

参考文献

[1]刘晓辰，张蓉，杨云霜. 原发性失眠症不同证型与焦虑、抑郁评分的关联性研究[J].陕西中医，2015,36(6)：693-695.

[2]Bolge SC,Joish VN,Balkrishnan R,et al.Burden of chronic sleep maintenance insomnia characterized by nighttime awakenings among anxiety and depression sufferers: results of a national survey[J].Prim Care Companion J Clin Psychiatry,2010,12(2): 824.

[3]Buguet A，Moroz D．Modafinil-medical consideration for use in sustained operations[J]．Aviat Space Environ Med，2003，74(6):659-663．

[4]Li JX，Yan JC，Pan F，et al． Effects of REM sleep deprivation on cognitive function and content of 52HT in rat frontal cortex[J]． Chongqing Medicine，2009，10( 38) : 1151-1153．

[5]陈鹏典，杨卓欣，黎杰运，等.针灸治疗失眠症的机制研究进展[J]．中国医药导报，2015，12(9)：43-46.

[6]夏东，王其一. 触觉经验对小鼠barrel cortex区域神经元c-fos、BDNF表达的影响及意义[J]．山东医药，2014,54(32)：23-25

[7]苏建军，李华丽，黄民，等．褪黑素对应激大鼠大脑核团c-fos表达的影响[J]．中国老年学杂志，2009，29(4):843-444．

[8]郭兴道，李炜，张癸荣，等. 睡眠剥夺对学习记忆及中枢神经系统相关分子的影响[J].神经药理学报，2012,2(6)：34-51.

[9]游秋云，王平，张舜波，等. 酸枣仁汤对REM睡眠剥夺老年大鼠脑神经细胞凋亡及c-fos基因表达水平的影响[J].世界睡眠医学杂志，2014,1(2)：71-74.

[10]陈杰，冯超，宋建宁.c-fos原癌基因在脑缺血应激反应中作用的研究[J].医学综述,2008,14(1): 56-58.

(收稿2016-01-05；修回2016-01-25)

【中图分类号】R256.23

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7369.2016.07.083

*陕西省教育厅专项科研计划项目(12JK1020)

△陕西中医药大学(咸阳712000)