淫羊藿苷对颅脑损伤大鼠血清MBP、GFAP表达的影响*

方永军　周雄波　周　锋　徐泽彪　胡珍渊　范小璇　韦鹏方

陕西中医药大学附属医院(咸阳 712000)



淫羊藿苷对颅脑损伤大鼠血清MBP、GFAP表达的影响*

方永军周雄波周锋徐泽彪胡珍渊范小璇韦鹏方△

陕西中医药大学附属医院(咸阳 712000)

摘要目的：探讨不同剂量淫羊藿苷对颅脑损伤大鼠血清MBP、GFAP含量的影响。方法：100只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、ICA低剂量治疗组(30mg/kg·d)、中剂量治疗组(60mg/kg·d)及高剂量治疗组(120mg/kg·d)。各组分别在造模后第1、3、7、14天取血，测定血清MBP、GFAP含量。结果：模型组与假手术组同期比较，MBP及GFAP含量增高，差异有统计学意义(P<0.05); 各治疗组与模型组同期比较，MBP及GFAP含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；高剂量治疗组与低剂量治疗组同期比较，MBP及GFAP含量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：Ica对创伤性脑损伤大鼠有脑保护作用，其作用与Ica剂量呈正相关，其机制与抑制MBP、GFAP 表达有关。

主题词颅脑损伤动物实验大鼠

颅脑损伤(traumatic brain injury，TBI)居全身创伤发生率的第二位，但致死率、致残率却高居首位。颅脑损伤患者医疗费用不断增加，美国国立卫生研究院调查显示[1]，一名严重颅脑损伤幸存者，如果得到精心的医治和护理，估计一生的花费可能超过400万美元。颅脑损伤多见于交通事故，亚洲开发银行的报告显示，中国交通事故也可能对经济构成威胁，使中国的年国内生产总值降低1%～3%[2]。由此可见颅脑损伤已成为一项世界性的严重的公共卫生问题。

中医药价格低廉，以其多途径、多靶点作用的特点，引起了学者的关注，越来越多的被用于各种脑损伤患者。近年的研究表明，淫羊藿苷(Icariin，Ica)具有抗痴呆、抗衰老作用，抗缺血性脑损伤作用，抗抑郁作用，神经保护作用，对老年性痴呆、缺血性中风、抑郁症等中枢神经系统疾病具有良好的防治作用[3]。但Ica对创伤性脑损伤的影响却鲜见报道。

国内外研究表明，髓鞘碱性蛋白(Myelin basic protein，MBP)和胶质纤维酸性蛋白(Glial fibillary acidic protein，GFAP)分别是少突胶质细胞髓鞘、星形细胞的特异性蛋白，在脑损伤时其在血清中的含量均有不同程度升高，其升高程度与病情严重程度及预后密切相关，并可作为指导临床治疗的客观指标[4]。本实验观察不同剂量淫羊藿苷对颅脑损伤大鼠血清MBP，GFAP含量的影响，报道如下。

1材料与方法

1.1动物分组及给药健康SPF级成年SD雄性大鼠100只，由西安交通大学实验动物中心提供，体重250g～300g。将动物随机分为5组，每组20只。假手术组：只开骨窗，不予落体撞击。0.9%氯化钠注射液2mL灌胃，造模前1次，造模后1次/d。模型组：只造模，不给Ica治疗。0.9%氯化钠注射液2mL灌胃，造模前1次，造模后1次/d。Ica低剂量组30mg/kg·d：0.9%氯化钠注射液2mL + Ica30mg/kg·d灌胃，造模前1次，造模后1次/d 。Ica中剂量组60mg/kg·d：造模后0.9%氯化钠注射液2mL +Ica60mg/kg·d灌胃，造模前1次，造模后1次/d。Ica高剂量组120mg/kg·d：造模后0.9%氯化钠注射液2mL +Ica120mg/kg.d灌胃，造模前1次，造模后1次/d。

1.2模型制作①SD大鼠称重后，10%水合氯醛0.3mL/100g腹腔注射麻醉；②将动物俯卧固定在立体定位仪上，调节门齿托的高度，使大鼠的前后囟处于同一水平；③消毒皮肤，头部正中切开，剥离骨膜，暴露右顶骨，用牙科钻在冠状缝后2mm，中线旁2mm处钻一直径4mm骨窗，保持硬脑膜完整。参照Feeny 等[5]方法制作大鼠颅脑损伤模型。打击后切口内滴入8万单位硫酸庆大霉素3～4滴，缝合头皮；④假手术组只开骨窗，不予落体撞击；⑤术后将大鼠在20℃～25℃恒温条件下饲养，每3天换垫料一次，自由活动及进食水。

1.3检测指标及方法ELISA 法检测：造模后第1、3、7、14天各组分别处死大鼠5只，腹主动脉采血，酶联免疫吸附法测血清MBP和GFAP水平。动物采血顺序按造模顺序进行，采血工作在半小时内完成，血样离心后取血清低温冷藏备用，统一按试剂盒说明检测。

2结果

模型组与假手术组同期比较，MBP及GFAP含量增高(P<0.05); 低剂量治疗组与模型组同期比较，MBP及GFAP含量降低(P<0.05)； 中剂量治疗组与低剂量治疗组及高剂量治疗组与中剂量治疗组同期比较，MBP、GFAP含量无明显差异(P>0.05)； 高剂量治疗组与低剂量治疗组同期比较，MBP及GFAP含量降低(P<0.05)。各组不同时间点血清MBP、GFAP含量比较(见表1)。

表1　各组大鼠血清MBP、GFAP含量比较

注：模型组与假手术组同期比较，*P<0.05；低剂量治疗组与模型组同期比较，△P<0.05；高剂量治疗组与低剂量治疗组同期比较，▲P<0.05

3讨论

TBI常引起神经元的坏死、神经髓鞘的崩解及血脑屏障(BBB)的破坏等原发性脑损伤， 还因伤后脑血流及脑细胞代谢变化、脑水肿形成和占位效应引起继发性脑损害，进一步引起脱髓鞘或髓鞘变性，使脑实质或髓鞘受到不同程度的损伤， BBB也可受到破坏，通透性发生改变。MBP是脊椎动物中枢神经系统少突细胞和周围神经系统雪旺细胞合成的一种强碱性膜蛋白，含有多种碱性氨基酸。MBP位于髓鞘多层膜结构的浆膜面， 与髓鞘脂质紧密结合， 维持了中枢神经系统髓鞘结构和功能的稳定。正常情况下，脑脊液MBP<6.95 mg/L，TBI时上述因素引起脑细胞膜完整性破坏从而导致MBP进入血液循环[6]。国外报道脑外伤后颈内静脉与外周静脉所测得的MBP浓度基本相同，因此通过检测外周血中MBP浓度即可反映脑损害严重程度[7]。李永领等研究结果显示，TBI患者伤后血清MBP水平有着不同程度的升高，脑损伤程度与MBP水平呈正相关，即脑损伤程度越重，MBP水平越高[8]。GFAP是星形胶质细胞中直径8μm～10μm的中间丝，位于核周和细胞质中，是构成胶质细胞的重要骨架成分，可作为星形胶质细胞的特异性标志，血清GFAP水平可用作评估TBI原发性损伤和判断预后[9]。TBI后脑组织损伤， GFAP 从损伤的星形胶质细胞漏出，通过破坏的BBB进入脑脊液和体循环，引起脑脊液和血液中GFAP水平升高。实验表明TBI后大鼠血清MBP浓度在伤后升高，常持续较高水平7～9d[10]， GFAP 在血清中的水平分别在伤后1～3d 达到最高值，如无继发性损害，则在伤后6～14d 明显下降[11]。

淫羊藿是传统补肾之中药，又称仙灵脾，是多年生的草本植物。据《中国药典》记载，其性味辛、甘、温，归肝、肾经，具有补肾壮阳、强筋骨、祛风除湿等功效。“肾生髓”是中医学重要观点之一，肾主藏精生髓，督脉上通于脑，下通于肾，而脊是精髓升降之通路；髓又上通于脑，脑为髓海，府精神明，才可作用强力，能多精巧。正如《中西汇通医经精义》云：“肾系贯脊，通于脊髓，肾精足，则入脊化髓上循入脑而为脑髓，是髓者精气之所会也。”脑与五脏均有联系，但与肾的关系最为密切。依据以上理论，补肾填髓可健脑益智。淫羊藿药理学研究表明，Ica是其主要有效成分。近年来，通过对Ica对中枢神经系统的药理作用及机制研究，Ica能够通过血脑屏障，抑制β淀粉样蛋白产生的毒性作用，降低脑组织中乙酰胆碱酯酶活性，保护神经[12]；Ica 能抑制缺氧引起的血管内皮细胞的减少，有效的减少缺氧诱导的血管内皮细胞损伤[13]；Ica可在体外刺激血管内皮细胞的增殖、迁移和血管生成[14]；Ica能一定程度的降低神经胶质细胞的通透性，抑制NO、前列腺素活性氧的释放及促炎细胞因子抑制胶质细胞增生活化、减轻炎症反应[15-16]。所以推测Ica可通过维持血管内皮细胞完整性，刺激内皮细胞的增殖，改善缺血-再灌注，减轻炎症反应，保护神经，对颅脑损伤后血清MBP与GFAP的表达产生影响。

本研究结果表明，假手术组大鼠血清MBP、GFAP 含量在术后各时间点无明显变化；模型组大鼠血清MBP、GFAP含量在术后均有升高，术后第1天开始明显升高，至第7天达峰值，后逐渐下降，至第14天仍明显高于假手术组。Ica对颅脑损伤后升高的血清MBP、 GFAP表达具有明显的抑制效果，各治疗组血清MBP、GFAP含量在术后第1、3、7、14天与模型组对比均有明显降低，同期高剂量治疗组血清MBP、GFAP水平比低剂量治疗组的血清水平明显降低。本实验结果表明，Ica对TBI大鼠具有脑保护作用，Ica的脑保护作用与其使用剂量呈正相关。其机制主要有两方面，一方面Ica改善TBI后脑微循环，保护了受损的神经细胞，加速了受损细胞的修复，清除氧自由基，减少了MBP、GFAP的释放；另一方面Ica保护受损血管的内皮细胞，改变了BBB的通透性，减少了MBP、GFAP进入血液，从而稳定BBB，降低血清MBP、GFAP的表达，减轻创伤性脑损伤的危害。

参考文献

[1]王忠诚.加强脑和脊髓外伤的预防教育[J].中华创伤杂志，1997，13(6)：327-328.

[2]袁强，胡锦.颅脑创伤经济负担研究进展[J].中国预防医学杂志，2012，13(2)：159-162.

[3]龚其海，杨丹莉，石京山，等.淫羊藿苷的神经药理作用及分子机制研究进展[J].中国新药与临床杂志，2011，30(7)：481-486.

[4]迟相林，李振光，郭兆荣，等. NSE、S100B蛋白、MBP、GFAP与缺血性脑卒中临床相关性研究进展[J].中国神经免疫学和神经病学杂志，2008，15(4)：308-310.

[5]Feeney DM，Boyeson MG，Linn RT，et al. Responses to cortical injury： Methodology and local effects of contusions in the rat[J]. Brain Res，1981，211(1)：67-77.

[6]陈晞，毛之奇，李波.血清S100B和MBP在颅脑损伤患者中的检测意义[J].广东医学，2006，27(7)：1008-1010.

[7]Woertgen C，Rothoerl RD，Wiesmann M，et al. Glial and neuronal serum markers after controlled cortical impact injury in the rat[J].Acta Neurochir Suppl，2002，81：205-207.

[8]李永领，朱烈烈，张荣，等.以颅脑伤为主的多发伤患者血清NSE和MBP的检测及意义[J].浙江医学教育，2012，11(3)：39-41.

[9]于芸，韩如泉. 生物标志物在创伤性颅脑损伤中的应用[J].国际麻醉学与复苏杂志，2013，34(2)：126-129.

[10]杨喜民，李迎国，朱剑功，等.脑外伤患者NSE和MBP含量变化及黄芪的作用研究[J].现代检验医学杂志，2008，23(3)：100-101.

[11]Kvesdi E，Lückl J，Bukovics P，et al. Update on protein biomarkers in traumatic brain injury with emphasis on clinical use in adults and pediatrics[J].Acta Neurochir，2010，152(1)： 1-17.

[12]肖幸丰，郑明，瞿林海，等.ICA伍用三七总皂苷对Aβ-淀粉肽25-35侧脑室注射所致大鼠行为异常及脑组织AchE活性的影响[J].中国现代应用药学杂志，2005，22(3)：178-181.

[13]吉瑞瑞，李付英，张雪静，等.ICA对缺氧诱导血管内皮细胞损伤的保护作用[J].中国中西医结合杂志，2005，25(6)：525-530.

[14]Kim，Jung Huan. Icariin stimulates angiogenesis by activating the MEK/ERK-and PI3K/Akt/ENOS-dependent signal pathways in human endothelial cell[J]. Biochem Biophys Res Commun，2008，376(2)：404-408.

[15]Zeng KW，Fu H，Liu GX，et al. ICAriin attenuates lipopolysaccharide-induced microglial activation and resultant death of neurons by inhibiting TAK1/ IKK/ NF-kappaB and JNK/ p38 MAPK pathways[J]. Int Immunopharmacol，2010，10(6)：668-678.

[16]甄瑾，李润今，王梅玲. ICA对阿尔茨海默病模型大鼠记忆能力及其海马内GFAP、TNF-α、IL-6 表达的影响[J]. 中西医结合心脑血管病杂志，2013，11(2)：192-194.

(收稿2016-03-16；修回2016-04-08)

The effects of Icariin on serum MBP and GFAP levels in traumatic brain injury rats

Affiliated Hospital of ShanXi College of Traditional Chinese Medicine(Xianyang 712000)

Fang YongjunZhou XiongboZhou Fenget al

ABSTRACTObjective：To investigate the effects of different doses of icariin(ICA) for traumatic brain injury (TBI) in rats serum myelin basic protein(MBP)and glial fibillary acidic protein(GFAP). Methods：100 SD rats were randomly divided into control group， model group， the ICA low dose treatment group (30 mg/kg·d)， middle dose treatment group (60 mg/kg·d) and high dose treatment group (120 mg/kg·d).The contents of serum MBP and GFAP were determined on day 1， 3， 7 and 14 after operation. Results：The results of model group compared with control over the same period， higher content of MBP and GFAP， the difference was statistically significant (P< 0.05); Each treatment group compared with model group at the same time， content of MBP and GFAP is reduced， the difference was statistically significant (P< 0.05);High dose treatment group compared with the same period lower dose treatment groups， MBP and GFAP content is reduced， the difference was statistically significant (P< 0.05). Conclusions ：The ICA in traumatic brain injury in rats with cerebral protection， its effect is positively related with the ICA dose， its mechanism is related to the inhibition of MBP， GFAP expression.

KEY WORDSTraumatic Brain InjuryAnimalExperimentationRats

【中图分类号】R651.15

【文献标识码】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7369.2016.07.080

*陕西省咸阳市科技计划项目(2012K16-01、2011K13-01)

△陕西中医药大学(咸阳 712000)