窖泥变质前后细菌群落差异分析

于春涛，刘　超，孙凤娥，刘振江（.沧州医学高等专科学校，河北沧州0600；.河北省宁晋县泥坑酒业有限责任公司，河北石家庄054000）



窖泥变质前后细菌群落差异分析

于春涛1，刘超1，孙凤娥1，刘振江2
（1.沧州医学高等专科学校，河北沧州061001；2.河北省宁晋县泥坑酒业有限责任公司，河北石家庄054000）

摘要：通过提取窖泥细菌总DNA，扩增16S rDNA构建基因文库，采用高通量测序的方法，对窖泥变质前后细菌群落进行分析。结果表明，窖泥变质前后细菌群落存在较大差异，共检测出16个门、174个种属。选取优势种属进行比较，窖泥变质前优势菌属为：动球菌属（22.63%）、芽孢杆菌属（12.95%）、紫单胞菌科（12.45%）、芽孢八叠球菌属（10.60%）等；窖泥变质后优势菌属为：芽孢八叠球菌属（61.34%）、嗜冷杆菌属（10.42%）、未分类菌属（5.45%）、子单胞菌属（5.02%）等。本研究初步揭示了窖泥变质前后细菌群落种类和数量的差异，为窖泥变质研究提供理论基础。

关键词：窖泥；变质；细菌群落；差异分析；高通量测序

优先数字出版时间：2016-04-25；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160425.0956.001.html。

窖泥在浓香型白酒生产中扮演了极其重要的角色，其中复杂的菌群与浓香型白酒中复杂的呈香呈味物质的形成直接相关［1-4］。在酿酒过程中，环境因素影响窖泥的细菌群落结构，菌群结构差异将影响窖泥的老熟或变质，从而影响酒的质量和风格。窖池中窖泥细菌群落结构分析和研究对于了解窖泥质量及其酒的香味和风格形成发挥着非常重要的作用，由于大多数窖泥中细菌是无法培养的，因此采用传统的细菌分离培养方法研究窖泥细菌群落存在很大的局限性［5-8］。

近年来，随着基于PCR扩增技术的各种微生物免培养方法应用于土壤微生物区系研究，有些学者尝试借助于现代分子生物学技术研究窖泥微生物群落。如：邓依等［9］采用16S-23S rRNA ITS-AFLP指纹图谱分析窖泥原核微生物多样性，陕小虎等［10］对利用PCR-DGGE技术研究窖泥微生物的电泳条件进行了优化和探讨，张文学等［9］利用16S rDNA克隆文库技术研究白酒发酵糟醅中微生物区系的构成及演变过程。利用高通量测序技术分析窖泥变质前后的细菌群落差异的研究相对较少。鉴于此，本实验使用某酒厂提供变质前后的两种窖泥，提取总DNA，经过两轮PCR扩增构建基因文库，通过高通量测序得到窖泥中90%以上相关细菌信息。

1材料与方法

1.1样品采集

窖泥样品取自河北某知名酒厂酿酒车间优质窖泥（FNK1）和变质窖泥（PNK1）。取样方法是FNK1从窖池的窖壁和窖底各取三点共100 g、PNK1从窖池的窖壁和窖底各取三点共100 g，分装后密封冷冻保存。

1.2实验方法

1.2.1窖泥预处理及总DNA提取［11］

称取0.2 g样品放入含有0.5 g磁珠的5 mL离心管中，加入1 mL SLX-mLus Buffer，漩涡2 min。经OMEGA土壤DNA提取试剂盒，反复冻融、离心，收集上清液。粗提的窖泥DNA通过PCR产物纯化试剂盒纯化，纯化后的窖泥DNA PCR扩增效果良好，Qubit2.0检测DNA浓度，琼脂糖凝胶检测DNA完整性。

1.2.2 PCR扩增及对产物进行琼脂糖凝胶电泳

PCR扩增引物选用已经融合了Miseq测序平台的16S rDNAV3-V4通用引物，341F引物：CCTACACGACGCTCTTCCGATCTN（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG，805R引物：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC。PCR体系按照如下进行：10×PCR buffer 5 μL，dNTP（10 mM each）0.5 μL，Genomic DNA 10 ng，Bar-PCR primer F （50 μM）0.5 μL，Primer R（50 μM）0.5 μL，Plantium Taq （5 U/μL）0.5μL，H2O add to 50 μL。配制好的PCR体系按照如下反应条件进行扩增：94℃变性3 min，做5个循环，分别是94℃变性30 s，45℃退火20 s，65℃延伸30 s；再做20个循环，分别是94℃变性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，72℃延伸5 min，然后进行第2轮扩增，引入lllumina桥式PCR兼容引物。PCR结束后，产物进行琼脂糖凝胶电泳，对DNA进行回收。

1.2.3 16S rDNA扩增片段的测序、质控和聚类

采用Misep测序平台对扩增片段进行双端测序，测得的基因序列经质量控制软件Prinsep处理，去除barcode、两端primer以及部分低质量基因序列，经质控后的基因序列长度大部分分布在400～600 bp之间，基本满足分析需要。

对测得的基因序列采用uclust软件进行OUT聚类，通常域值的序列相似性定位0.97，操作分类单元被认为可能属于属。

1.2.4对处理后序列进行物种分类，比较窖泥变质前后菌群结构差异

物种分类采用的软件为RDP classifier，基于OUT聚类的结果，获取每一个OUT聚类的代表序列，分别是长度最长序列（length）、丰度最大序列（abundance）和所有序列（ALL）形成3份结果，并对各类RDP分析。本文所有的展示，均使用OUT＿ALL中的数据，genus水平进行展示，采用柱形图及表格的形式对比窖泥变质前后群落结构差异。

2结果与分析

2.1窖泥变质前后细菌16SrDNAV3—V4电泳图谱（图1）

图1　　细菌16S rDNAV3—V4电泳图谱

结合图1中的3条泳道对比得知，泳道1和泳道2有较清晰地条带，条带大小位于400～600 bp之间，DNA提取时一般都通过试剂盒过柱提取，这种柱子有固定孔径，从而决定了基因组片段的大小。泳道1比泳道2亮，说明窖泥变质后细菌数量和丰度均有所提高。

2.2窖泥变质前后16S rDNA多样性分析

扩增后的PCR产物去除嵌合体和靶区域序列，得到的基因序列数见表1。

表1　处理后基因序列统计表

将多条序列按其序列间的距离对它们进行聚类，后根据序列之间的相似性作为域值分成操作分类单元（OTU），通常域值的序列相似性定为0.97，操作分类单元被认为属于属［21-23］。采用OUT VENN分析图统计样本中共有的和独有的OUT数目，直观展示出窖泥变质前后OUT数目的差异（图2）。PNK1有2857个OTUs，FNK1 有2344个OTUs，两者共有553个OTUs。说明窖泥变质后，细菌的种类和丰度有所提高。

图2　　窖泥变质前后OUT数

2.3细菌群落结构分析

对处理后序列，采用RDP classifier软件对每条序列在genus水平上计算其分配到此rank中的概率值，一般概率值大于0.8，即RDP分类域值［24-25］。根据分类学分析结果，可以得知样品在属分类水平的数据，样本中菌群的reads数目，也就是菌群的丰度值（表2、表3）。

表2　窖泥变质前细菌种类及丰度值

表3　窖泥变质后细菌种类及丰度值

采用柱形图比较FNK1和PNK1种属丰度值（图3）。

图3　 FNK1和PNK1细菌种属丰度值对比

结合表2、表3、图3可知，窖泥变质前后细菌群落结构、丰度差异较大，选择优势菌群进行比较。芽孢八叠球菌属（Sporosarcina）在FNK1和PNK1所占比例为10.60%和61.34%，动球菌属（Planococcaceae incertae sedis）在FNK1和PNK1所占比例为22.63%和0.75%，紫单胞菌科（Proteiniphilum）在FNK1和PNK1所占比例为12.45%和5.02%，芽孢杆菌属（Bacillus）在FNK1和PNK1所占比例为12.95%和2.40%，类芽孢菌属（Paenibacillus）在FNK1和PNK1所占比例为8.68%和2.15%，嗜冷杆菌属（Psychrobacter）在FNK1和PNK1所占比例为0%和10.42%，枝芽孢菌属（Virgibacillus）在FNK1和PNK1所占比例为8.38%和0.63%，未分类菌属（unclassified）在FNK1和PNK1所占比例为1.24%和5.45%，产气荚膜梭菌属（Clostridium IV）在FNK1和PNK1所占比例为4.09%和0.10%。

3　讨论

窖池窖泥发酵是中国白酒生产工艺的特色之一，对窖泥中微生物群落结构的研究可为进一步正确认识白酒风味因子形成机理、窖泥微生物分布、窖泥变质微生物分析有着积极的意义。本研究通过高通量测序的方法分析浓香型白酒窖池窖泥中细菌群落结构，重点分析了窖泥变质前后细菌群落差异［12-16］。变质后的窖泥出现板结坚硬、白色盐析、腐臭味的现象，原因是酿酒车间环境和窖泥营养条件的变化导致微生物菌群结构发生变化，最终导致物质代谢发生改变，致使窖泥变质［17-20］。16S rDNA序列分析表明，窖泥变质前后细菌菌群均比较丰富。窖泥变质前优势菌属为动球菌属（22.63%）和芽孢八叠球菌属（10.60%），窖泥变质后的细菌丰度有显著升高，优势菌属为芽孢八叠球菌属（61.34%）和嗜冷杆菌属（10.42%）。

芽孢八叠球菌属为有机化能营养，产生能量的代谢是严格的呼吸型代谢，氧是最终电子受体，严格需氧。此属包含2种为人所知的种类：脲芽孢八叠球菌和嗜盐八叠球菌，后者起于海洋，生长过程中需要Na+；脲芽孢八叠球菌能有效的把尿素降解为CO2和NH3，这样使得无缓冲能力的培养基的pH值显著升高。嗜冷杆菌属在窖泥变质后含量有较大幅度的提升，查阅资料没有找到其相关信息。

本研究只分析了窖泥变质前后细菌的群落组成，课题组将继续研究窖泥古生菌和真菌群落差异，以期获得窖泥微生物全貌，为研究窖泥变质原因提供参考。

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中图分类号：TS261.1；Q93-3；TS262.3；TS261.4

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016）05-0061-04

收稿日期：2016-03-17

作者简介：于春涛（1979-），男，河北人，硕士，研究方向为微生物发酵，E-mail：aimiao818@163.com。

Analysis of the Difference in Bacterial Communities in Pit Mud Before and After the Deterioration

YU Chuntao1，LIU Chao1，SUN Feng'e1and LIU Zhenjiang2
（1.Cangzhou Medical College，Cangzhou，Hebei 061001；2.Ningjin Nikeng Distillery Co. Ltd.，Shijiazhuang，Hebei 054000，China）

Abstract：The bacterial communities in pit mud before and after the deterioration were analyzed by high throughput sequencing DNA technology through the extraction of total bacterial DNA and the construction of gene library by amplification of 16S rDNA. The results showed that，there were significant difference in bacterial communities in pit mud before and after the deterioration，bacteria of 16 phylum and 174 genus in total were detected，the dominant bacteria in pit mud before the deterioration included Planococcaceae（22.63%），Bacillus（12.95%），Proteiniphilum（12.45%），Sporosarcina（10.60%）etc.，and the dominant bacteria in pit mud after the deterioration included Sporosarcina（61.34%），Psychrobacter（10.43%），unclassified bacteria（5.45%），Proteiniphilum（5.02%）etc. This study provided a theoretical base for the research on pit mud deterioration.

Key words：pit mud；deterioration；bacterial community；analysis of the difference；high throughput sequencing