基质辅助激光解析电离飞行时间质谱用于产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌ST11分型的研究

李晓红，丁进亚，刘　杰，公彦文，薛文成，赵　斌



·论著·

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱用于产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌ST11分型的研究

李晓红1，丁进亚2，刘杰3，公彦文4，薛文成5，赵斌6

目的探讨基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)用于产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌ST11分型。方法收集2012年10月-2014年10月5所医院的80株产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌菌株。经多位点序列分析(MLST)，28株为ST11型，52株为其他分型(other sequence type, OST)。通过MSP dendrogram聚类分析、MALDI Biotyper建立数据库、ClinPro Tools建立模型3种方法研究ST11分型的可能性。结果MSP dendrogram聚类分析在距离水平线1000处可将80株菌聚类分析为两类，敏感性为65.78%，特异性为92.85%。MALDI Biotyper数据库验证结果：18株ST11有1株菌分为OST，32株OST有2株菌被分为ST11，敏感性为89.47%，特异性为96.77%。ClinPro Tools用其余菌株验证模型全部正确，敏感性和特异性均为100%。结论MALDI-TOF MS可通过3种方法区别ST11与OST，以ClinPro Tools软件建立模型的方法最可靠。

ST11型；肺炎克雷伯菌；碳青霉烯酶；MALDI-TOF MS

肺炎克雷伯菌是医院感染常见的病原菌，其多重耐药菌株增加了抗感染治疗的难度。为防止其在院内形成暴发流行，建立对其快速监测和分型的方法有重要意义[1-2]。脉冲场凝胶电泳和多位点序列分析(MLST)是常用的肺炎克雷伯菌分型方法，但均耗时、费力且价格昂贵[3-4]。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)是新近发展的简便、快速、准确、经济的病原微生物鉴定方法[5-6]。本文旨在探讨MALDI-TOF MS用于产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌ST11分型的可能性。

1　材料与方法

1.1菌株来源收集2012年10月-2014年10月沈阳、北京、武汉、济南等地5所医院分离出的80株产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌，其中28株为ST11型，52株为其他分型。所有菌株改良Hodge试验均为阳性。

1.2仪器PCR试剂购自博迈德生物，GeneAmp PCR System 9700PCR扩增仪(PE公司，美国)；北京赛默飞羊血琼脂培养基；珠海迪尔肉汤培养基；Bruker BioTyper质谱分析仪、Flexcontrol 3.4、MALDI Biotyper 3.1、ClinPro Tools软件3.3.0版本(布鲁克公司，德国)；基质：a-氰基-4-羟基肉桂酸饱和溶液，2.5%三氟乙酸(sigma)，70%甲酸，乙腈。

1.3方法

1.3.1MLST分型参照网站http://bigsdb.web.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html设计7对管家基因的引物、PCR反应体系及参数。产物由北京华大公司进行测序，再将序列结果与MLST网站比对，查询得出结果。

1.3.2样本前处理所有菌株接种于血琼脂平板，35 ℃孵育18 h后，挑取单个菌落转种于600 μL肉汤培养基中孵育18 h，13 000×g离心2 min，弃上清液，加入300 μL去离子水混匀，再次离心弃上清液，重复2次。加入300 μL去离子水混匀，再加入900 μL乙醇，充分混匀，离心弃上清液。室温下干燥沉淀2～3 min，加入70%甲酸20 μL混匀，再加入20 μL乙腈混匀，离心取1 μL上清液和1 μL的基质溶剂混和后置于96孔钢制靶板表面晾干后上机。

1.3.3MALDI-TOF MS原理MALDI-TOF MS的原理是根据特异性保守核糖体蛋白鉴定微生物，在电场和磁场的作用下，测定离子到达检测器的飞行时间而得到质荷比(m/z)，其与离子的飞行时间成正比，从而绘出样本的蛋白图谱(指纹图谱)，通过与数据库中的指纹图谱相比较来鉴定微生物。用大肠埃希细菌标准品进行曲线校正，检测器范围为2000～20 000 m/z。

1.3.4MSP dendrogram聚类分析通过质谱鉴定系统(MALDI Biotyper软件)对80张图谱进行聚类分析得出代表亲缘关系远近的聚类树状图(main spectrum dendrogram, MSP dendrogram)，分析菌株间的亲缘性。

1.3.5MALDI Biotyper建立数据库盲选10株ST11的20张图谱(同一株菌选取2张，不同的两个靶孔)，以及盲选20株OST的20张图谱(1个株菌选取1张)，通过MALDI Biotyper建立数据库，其余50株菌用于验证数据库的敏感性和特异性。

1.3.6ClinPro Tools建立模型盲选8株ST11、20株OST，通过ClinPro Tools软件中的遗传算法(genetic algorithm, GA)建立模型，并计算模型的交叉效度与可接受度，该软件可以对数据进行坎基线、平滑、标准化、重新校准，以及平均峰值列表计算等自动化前处理，其余52株菌用于验证模型。

2　结　果

2.1MSP dendrogram聚类分析结果MSP dendrogram在距离水平线1000处将80株菌分为两类，其中42株菌中包含39株OST，另38株菌中包含25株ST11，敏感性为65.78%，特异性为92.85%。而在距离水平线900处可分为3类，分别为11、31、38株(图1)。

2.2数据库建立及结果10株ST11和20株OST各自建立数据库，以此数据库为标准，对剩余菌株进行检测，ST11组剩余18株菌中鉴定正确的有17株，OST组剩余32株菌中2株鉴定为ST11，敏感性为89.47%，特异性为96.77%。

2.3模型建立及验证结果GA计算所建模型的交叉效度与可接受度均为100%。软件通过所设参数选出模型中ST11的特异性峰有：2761.72、4521.44、5941.94、7790.48、9645.62 m/z。用其余菌株验证模型，20株ST11和32株OST全部分型正确，敏感性和特异性为100%。模型菌株分布见图2。

3　讨　论

MALDI-TOF MS方法鉴定病原微生物准确性高，且有时间和成本的优势，使其在临床微生物检测领域具有非常广阔的前景。国外已有许多实验室应用于临床实践。文献报道ClinPro Tools软件根据质荷比、信噪比、峰下面积等数据对菌株进行分型，且具有较高的敏感性和特异性。如辨别对甲氧西林敏感与耐药的金黄色葡萄球菌、准确快速地鉴别5种高危害克隆型的铜绿假单胞菌、化脓性链球菌血清型聚类、以及肺炎支原体亚型分析。本实验研究探讨了通过质谱仪配置的MSP dendrogram聚类分析、MALDI Biotyper建立数据库、ClinPro Tools建立模型3种方法对产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌ST11分型的可能性。

图1　MSP dendrogram 聚类分析结果图

×为ST11，o为OST图2　ST11与OST建立模型菌株分布图

MSP dendrogram在距离水平线1000处可分为两类，28株ST11中有25株分为一类，虽然MSP dendrogram聚类分析敏感性不高为65.78%，但特异性为92.85%，表明该法可把ST11与其他型分开。MALDI Biotyper数据库的建立需要>20张图谱，由于ST11型菌株数量的限制，我们用同一株菌的两张图谱建立数据库。数据库验证结果显示18株ST11有1株菌分错，32株OST中有2株菌分错，敏感性为89.47%，特异性为96.77%，说明MALDI Biotyper建立数据库法能较好地区分ST11与OST，并且该方法最为方便、快速，可在鉴定菌株的同时对菌株进行分型。有文献报道，MALDI Biotyper区分产β-内酰胺类大肠埃希菌ST131与ST405和OST的敏感性为98.5%，特异性为93.9%[10]。可能本研究的实验组与对照组菌株数量少，限制了MALDI Biotyper区分ST11的敏感性，需进一步收集实验菌株来研究MALDI Biotyper区别ST11与OST的能力。

ClinPro Tools软件通过遗传算法、快速分类法、神经网络算法3种高级数学算法计算所建模型的交叉效度与可接受度。交叉效度是计算模型可靠性的指标，可接受度是衡量数据通过模型正确分类的指标，并且代表计算模型的性能，实验组的可接受度相当于敏感性，对照组的可接受度相当于特异性[10]。本研究所建模型的交叉效度与可接受度均为100%，并且用剩余菌株验证模型，显示ClinPro Tools可以正确地区分ST11和OST，敏感性和特异性均为100%。同时，ClinPro Tools可以找出模型ST11的特异性峰，分别为2761.72、4521.44、5941.94、7790.48、9645.62 m/z。软件还可通过受试者工作特征曲线(ROC曲线)计算ST11的曲线下面积，当AUC=1时，峰值为2761.73，AUC=0.997时，峰值为4521.42。所以2761.73 m/z和4521.42 m/z可能是ST11的最具特异性峰，表明ClinPro Tools软件可正确、快速地区分出产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌ST11型，并且能够找出其特异性峰。

MALDI-TOF MS可通过3种方法区别ST11与OST，以ClinPro Tools软件建立模型方法最可靠。本研究收集的菌株以ST11为主，其他型别菌株数较少，故未对其他型别的菌株进行分组鉴别，有待于进一步研究。质谱分析技术操作简单、成本低、快速准确，且有文献报道MALDI-TOF MS可以快速、准确地检测出产碳青霉烯酶的细菌[11-12]，可作为检测产碳青酶烯酶肺炎克雷伯菌和对菌株进行克隆分型的方法，有进一步深入研究的价值。

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(本文编辑：齐名；英文编辑：王建东)

A studyof typing ST11 of klebsiella pneumoniae producing carbapenemases by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry

LI Xiao-hong1, DING Jin-ya2, LIU Jie3,GONGYan-wen4,XUEWen-cheng5,ZHAOBin6.

1.ClinicalLaboratory,theThirdAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,Xinxiang，Henan453003,China;2.ClinicalLaboratory,GeneralHospitalofGuangzhouMilitaryAreainWuhan,Wuhan，Hubei430070，China;3.ClinicalLaboratory,GeneralHospitalofBeijingMilitaryCommand,Beijing100026，China;4.ClinicalLaboratory,GeneralHospitalofJinanMilitaryCommand,Jinan，Shandong260000，China;5.ClinicalLaboratory,GeneralHospitalofShenyangMilitaryCommand,Shenyang，Liaoning110016，China;6.GeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,Nanjing,Jiangsu210002，China

ObjectiveTo study the probability of typing ST11 of klebsiella pneumoniae producing carbapenemases by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry. MethodsFrom October 2012 to October 2014, we collected 80 isolates of klebsiella pneumoniaes producing carbapenemases. We researched all isolates by MLST finding that 28 isolates were ST11 and 52 isolates were other sequence types. Through MSP dendrogram, creating databases by MALDI Biotyper and building models by ClinPro Tools to analysis the probability of typing ST11. ResultsAt the distance level cutoff of 1000, 80 isolates were divided into two clusters. The susceptibility with MSP dendrogram was 65.78%, and the specificity was 92.85%. The results of testing databases were that 1 of 18 ST11 and 2 of 20 OST were false. The susceptibility and the specificity with MALDI Biotyper were respectively 89.47% and 96.77%. The results of checking model with remaining isolates by the ClinPro Tools were all correctly. The susceptibility and specificity were both 100%. ConclusionThrough three methods,MALDI-TOF MS has detection performance for the ST11 and OST, but ClinPro Tools is the best.

ST11; klebsiella pneumonia; carbapenemases;MALDI-TOF MS

辽宁省科技攻关计划(2011225021)

1. 453003河南新乡，新乡医学院第三附属医院检验科；2. 430070湖北武汉，广州军区武汉总医院检验科；3. 100026北京，北京军区总医院检验科；4. 260000山东济南，济南军区总医院检验科；5. 110016辽宁沈阳，沈阳军区总医院检验科；6. 210002江苏南京，南京军区南京总医院医务部

赵斌，E-mail:156126607@qq.com

R378

A

10.3969/j.issn.1672-271X.2016.03.005

2016-03-11；

2016-04-25)

引用格式：李晓红，丁进亚，刘杰，等.基质辅助激光解析电离飞行时间质谱用于产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌ST11分型的研究.东南国防医药，2016,18(3):240-243.