类风湿关节炎患者TH17细胞及其相关细胞因子的表达及临床意义

林　琳，程艳杰

(大连医科大学附属第一医院 检验科，辽宁 大连 116011)



类风湿关节炎患者TH17细胞及其相关细胞因子的表达及临床意义

林琳，程艳杰

(大连医科大学附属第一医院 检验科，辽宁 大连 116011)

[摘要]目的探讨类风湿关节炎(RA)患者TH17细胞及其相关细胞因子的表达及临床意义。方法收集大连医科大学附属第一医院门诊RA初治活动期患者的外周血标本32例为活动期RA组，健康献血者30例为健康对照组，所有受试者清晨空腹坐位肘静脉采血。应用酶联免疫吸附法(ELISA)及反转录PCR(RT-PCR)法，分别检测外周血血清中IL-17水平和外周血单个核细胞(PBMC)中IL-17mRNA表达水平；将PBMC一组不加刺激，另一组用佛波酯(50 ng/mL)和离子霉素(1 μg/mL)刺激4 h后，流式细胞仪检测TH17细胞数量。结果活动期RA患者血清IL-17水平(15.76±0.62) pg/mL与健康对照组(8.67±0.12) pg/mL比较，差异有显著性意义(P<0.05)。活动期RA患者PBMC的IL-17mRNA表达水平(1.94±0.46)与健康对照组(0.84±0.16)比较，差异有显著性意义(P<0.05)。RA组血清IL-17水平与mRNA表达水平呈正相关(r=0.70, P<0.05)，且与疾病活动程度(DAS28)评分呈正相关(r=0.99, P<0.05)。活动期RA患者外周血TH17细胞比例(2.50±0.54)%与健康对照组(0.03±0.00)%比较，差异有显著性意义(P<0.05)。但刺激组(3.23±0.05)%与无刺激组(2.50±0.54)%比较，差异无显著性意义(P>0.05)。RA患者组TH17细胞数量与疾病活动程度(DAS28)评分呈正相关(r=0.96, P<0.05)。结论活动期RA患者TH17细胞及其主要效应性细胞因子IL-17在细胞、蛋白和基因表达水平上均明显升高并与疾病活动程度呈正相关，对临床制定治疗方案、判断疗效有指导意义。

[关键词]类风湿性关节炎;TH17细胞;IL-17;IL-17mRNA;RT-PCR;流式细胞仪

[引用本文]林琳,程艳杰.类风湿关节炎患者TH17细胞及其相关细胞因子的表达及临床意义[J].大连医科大学学报，2016,38(3)：232-236.

类风湿性关节炎(RA)是中国高发的一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病。目前的主要治疗原则是使患者获得尽可能长的完全缓解期，以非甾体抗炎药、免疫抑制剂、抗风湿类药等为主，对肝肾功能有损害，因此更需要明确RA的病因及其新的治疗靶点。近年来对自身免疫性疾病动物模型实验，即自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)[1]和胶原诱导的关节炎(collagen-induced arthritis, CIA)[2]的研究中发现，体内注射抗IL-17中和性抗体能够降低自身免疫性疾病的发生，减轻疾病的严重程度。CIA模型动物免疫接种重组IL-17的病毒样颗粒后，小鼠体内IL-17抗体滴度升高，并且使疾病的严重程度降低[3-4]。与来自动物模型的大量证据相比，对人TH17细胞以及患者的该群细胞诱导自身免疫病的能力知之尚少。最近研究显示，RA活动期IL-17生成增加，提示了IL-17与RA发病相关[5]。目前已经鉴定出的TH17细胞表面的分子标记包括CD4、CD45RO、CCR6、CCR4等[6-7]，但是还没有发现该细胞亚群具有特异性的表面标志。虽然IL-17能在多种细胞中检测到，如嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和单核细胞，但IL-17主要是由T淋巴细胞产生，如活化的CD4+T细胞[8]。因此可用IL-17阳性细胞占CD4+T细胞的百分比来鉴定TH17细胞亚群数量。本研究通过观察活动期RA患者外周血CD4+IL-17+T细胞鉴定TH17细胞数量和其分泌的IL-17以及外周血单个核细胞(PBMC)中IL-17mRNA的表达水平，探讨TH17细胞在RA发病中的作用。

1材料和方法

1.1研究对象

收集2013年7月至2014年2月大连医科大学附属第一医院门诊RA初治活动期患者的外周血标本，共计32例，其中男性7例，女性25例，平均年龄(51±6)岁。所有病例均符合1987年美国风湿病学会(American College of Rheumatology, ACR)修订的RA分类标准[10]并除外肿瘤、炎症及其它自身免疫性等疾病。所有RA患者均由风湿病专科医生填写RA病例调查表，并对疾病活动程度进行评估，活动期RA：(1)符合ACR 1987年制定的分类标准；(2)3个或3个以上的关节肿胀，并有以下附加条件中的至少两条：晨僵时间≥1 h；ESR≥28 mm/h；CRP增高≥1.5倍正常值；5个或以上的关节有压痛。根据RA患者的临床表现及实验室检查结果，计算DAS28评分。对照组：收集大连市中心血站2013年8月至2014年1月的健康献血者，共30例，男9例，女21例，平均年龄(47±4)岁，均未被检查出患有任何疾病。将RA患者外周血单个核细胞(PBMC)再分为刺激组和非刺激组。

1.2标本收集

采集所有受试者清晨空腹坐位肘静脉血2 mL，采用分离胶促凝管，3500 r/min离心10 min，分离血清用于IL-17的检测。采集所有受试者清晨空腹坐位肘静脉肝素抗凝静脉血3 mL，用于PBMC的提取。

1.3试剂与方法

人目的基因IL-17 119 bp上游引物TGTCCACCATGTGGCCTAAGAG，下游引物GTCCGAAATGAGGCTGTCTTTGA和看家基因GAPDH 196 bp上游引物GAAGGTGAAGGTCGGAGT，下游引物GAAGATGGTGATGGGATTTC，引物参考国外文献设计[6-8]，由大连宝生物公司合成，IL-17 ELISA试剂盒购自美国BD公司，佛波酯和离子霉素购自SIGMA公司,CD4-FITC和IL-17-PE购自美国eBioscience公司。

应用酶联免疫吸附法及反转录法(以RA患者PBMC中提取的总RNA为模板，用构建PCR引物调取管家基因GAPDH及目的基因IL-17)，分别检测外周血血清中IL-17水平和外周血单个核细胞(PBMC)中IL-17mRNA表达水平。以Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，以含10%胎牛血清的1640培养液重悬细胞，刺激组用(50 ng/mL)佛波酯和(1 μg/mL )离子霉素6孔板刺激培养4 h。抗CD4-PE和抗IL-17-FITC标记，流式细胞仪检测CD4+IL-17+T细胞的数量。

1.4结果判定

ELISA结果判定采用半定量方法S/CO(pg/mL)。RA患者及外周血PBMC中IL-17mRNA表达水平，根据读取的灰度值与内参的比值分析结果。流式细胞仪上PBMC可分为几个亚群，框定淋巴细胞群并以同型对照确定各荧光的分界游标后，软件分析显示待测样品的图像和各亚群细胞的百分率。

1.5统计学方法

2结果

2.1血清IL-17水平

活动期RA患者血清IL-17水平(15.76±0.62) pg/mL与健康对照组(8.67±0.12) pg/mL比较，差异有显著性意义(P<0.05)。

2.2PBMC中IL-17mRNA表达水平

活动期RA患者PBMC的IL-17mRNA表达水平(1.94±0.46)与健康对照组(0.84±0.16)比较，差异有显著性意义(P<0.05)，见图1和2。外周血IL-17与IL-17mRNA水平及DAS评分均呈正相关(r=0.70和0.99；均P<0.05)，见图3和4。

图1　活动期RA患者PBMC中I-17mRNA表达水平

图2　健康对照组PBMC中IL-17mRNA表达水平Fig 2 The IL-17mRNA level of PBMC in normal group

图3　RA患者外周血IL-17与IL-17 mRNA的水平的相关性分析(n=32)Fig 3 Correlation of IL-17 protein and mRNA in the peripheral blood of RA patients (n=32)

图4　RA患者外周血IL-17水平与DAS28评分相关性分析(n=32)Fig 4 Correlation of IL-17 levels and DAS28 core in the peripheral blood of RA patients (n=32)

2.3CD4+IL-17+T细胞比例

活动期RA组CD4+IL-17+T淋巴细胞比例明显高于健康对照组(P<0.01)，但刺激组与未刺激组CD4+IL-17+T细胞比例无明显差异。见表1。未刺激组与刺激组细胞状态见图5，流式细胞仪检测CD4+IL-17+T淋巴细胞比例(未刺激组/刺激组/对照组)见图6。RA患者CD4+IL-17+T细胞与DAS评分呈正相关(r=0.96,P<0.05)，见图7。

表1　RA患者外周血CD4+IL-17+T细胞的比例

组别CD4+IL-17+T细胞(%)活动期RA组(n=32) 刺激组3.23±0.05 未刺激组2.50±0.54健康对照组(n=30)0.03±0.00

活动期RA组与健康对照组比较，P<0.01; 刺激组与未刺激组比较，P>0.05

图5　未刺激组与刺激组细胞形态 (×400)Fig 5 Cell morphology in the non-stimulation group and stimulation group (×400)A：未刺激组；B：刺激组

图6　流式细胞仪检测CD4+IL-17+T淋巴细胞 Fig 6 The proportion of CD4+IL-17+ cells in each group by flow cytometry A：未刺激组；B：刺激组；C：对照组

图7　RA患者CD4+IL-17+T细胞与DAS28评分的关系Fig 7 Correlation of CD4+IL-17+ T cells and DAS28 core in the peripheral blood of RA patients

3讨论

活动期RA患者血清中IL-17A的水平明显高于健康对照组(P<0.05)，活动期RA的PBMC IL-17mRNA的表达水平也高于正常对照组(P<0.05),且血清中IL-17A水平与PBMC IL-17mRNA表达水平呈正相关，表明活动期RA患者外周血存在着基因转录水平和蛋白质翻译水平上IL-17的一致性高表达，提示IL-17的表达与RA疾病关系密切；以分泌IL-17为主要效应性细胞因子的TH17细胞，在RA发病活动过程中其功能是活跃的，且与RA疾病活动程度呈正相关的关系，进一步证实了TH17细胞通过一定机制参与RA患者疾病的发生和发展。对这种机制的进一步研究，将有可能通过调节IL-17mRNA的表达来降低RA患者的疾病活动性，从而达到治疗关节炎症的目的。另外，RA活动期患者外周血表达、分泌IL-17水平明显升高，且其水平高低可反映疾病的活动程度，这对临床制定治疗方案，判断疗效有指导意义。用流式细胞技术检测了RA患者外周血中CD4+IL-17+T细胞的数量，活动期RA患者外周血CD4+IL-17+T细胞比例明显升高(P<0.01)，说明活动期RA患者外周血中存在异常增多的TH17细胞，这与患者血清中IL-17水平升高的结果相一致。这群异常增多的TH17细胞通过分泌大量的细胞因子IL-17参与RA的发病过程。

本研究发现，细胞内细胞因子染色前加入PMA和钙离子载体对细胞进行刺激，CD4+IL-17+T淋巴细胞比例不高于未加刺激对照组(P>0.05)，这与黄昂等[9]的研究结果不一致。分析其原因：有研究报道在PMA的刺激下细胞表面的CD4抗原会被内吞，使得检测出的CD4+IL-17+双阳性细胞比例偏低，但CD8的表达在这个过程中不受影响，因此可以通过CD3+和CD8-细胞反设门来确定CD4细胞亚群，即CD3+CD8-IL-17+T细胞的比例可能更加接近于TH17细胞的实际数量[10]。黄昂等[9]研究表示，在加入PMA和钙离子载体刺激后，加入蛋白转运抑制剂会提高IL-17+T细胞检出率，但是在预实验阶段，发现蛋白转运抑制剂(莫能霉素)的加入，细胞呈现蛋白变性的状态，后期舍弃了加入蛋白转运抑制剂组的对比试验。这对体外检测人TH17细胞频率方法有参考价值。

本研究通过检测RA患者外周血TH17细胞亚群的数量、细胞因子以及mRNA的表达水平，进一步证实了TH17细胞在数量和功能上与RA疾病活动程度的关系，这对临床制定治疗方案，判断疗效有指导意义。

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作者简介:林 琳(1984-),女,辽宁沈阳人，主管技师。E-mail:linlin_work@yeah.net 通信作者：程艳杰，教授。E-mail:2845662180@qq.com

doi:论著10.11724/jdmu.2016.03.06

[中图分类号]R593.22

[文献标志码]A

文章编号：1671-7295(2016)03-0232-05

(收稿日期：2016-03-05；修回日期：2016-05-20)

Clinical significance of TH17 cells and related cytokines expression in RA patients

LIN Lin, CHENG Yan-jie

(DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China)

[Abstract]Objective To investigate TH17 cells and their cytokine expression in rheumatoid arthritis patients, which may play a positive role in clarifying the pathogenesis of RA. Methods Utilizing Enzyme-linked immunosorbent assay and reverse transcription PCR methods, IL-17 protein in serum and mRNA in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were measured in RA patients. TH17 cells were detected by flow cytometry in a group without stimulation and the other group with phorbol ester (50 ng/mL) and ionomycin (1 μg/mL) stimulation for 4 hours. Results Serum IL-17 levels in active RA patients were significantly higher than those in the normal control group (15.76±0.62) pg/mL vs. (8.67±0.12) pg/mL (P<0.05). PBMC IL-17 mRNA expression in active RA patients were significantly higher than the normal control group (1.94±0.46) vs. (0.84±0.16) (P<0.05). IL-17 protein levels were positively associated with mRNA expression levels (r=0.70, P<0.05). Serum IL-17 level of RA patients and disease activity (DAS28) score were positively correlated (r=0.99, P<0.05). In the peripheral blood of RA patients, TH17 cells proportion increased (2.50±0.54)% vs. (0.03±0.00)% (P<0.01), and there was no difference between stimulation and non-stimulation groups (3.23±0.05)% vs. (2.50±0.54)% (P>0.05). TH17 cells of RA patients and disease activity (DAS28) score were positively correlated (r=0.96, P<0.05). Conclusion In active RA patients, TH17 cells and their cytokine expression are significantly increased in the levels of cell, protein and mRNA, which suggests that TH17 cells might play an important role in the pathogenesis of RA.

[Key words]Rheumatoid arthritis (RA); TH17 cells; IL-17;IL-17mRNA; RT-PCR; flow cytometry