微载体悬浮培养技术在疫苗生产中的应用

王蔚曦，黄晓琴乾元浩生物股份有限公司南京生物药厂

微载体悬浮培养技术在疫苗生产中的应用

王蔚曦，黄晓琴
乾元浩生物股份有限公司南京生物药厂

微载体悬浮培养技术是一种新的细胞培养技术，并已被国外疫苗生产企业应用大规模生产中，但这项技术在国内并不普及。本文以介绍国内当前疫苗生产技术切入，阐述了微载体悬浮培养技术的独特优势和过程优化，并分别介绍了微载体悬浮培养技术在实验室和大规模培养中的研究进展，最后展望了此技术在未来的发展方向。

微载体悬浮培养技术；疫苗生产；过程优化；研究进展

随着科技的发展，疫苗生产技术日新月异。而细胞苗以其成本低，产量高，安全性好而倍受各家厂商青睐。作为细胞苗生产的关键环节细胞大规模培养技术也正迎来巨大的革新。

1　现阶段动物疫苗生产中的细胞培养技术

1.1贴壁培养

贴壁培养是指使细胞静置贴在容器表面，并不断生长繁殖而形成单层的培养方法。

此方法的优点有：容易完全换液，细胞清洗方便，无需离心；可在显微镜下直接观察到细胞的形态和生长状态，如病毒感染后出现的细胞病理性改变，细胞诱导分化或致癌因素引起的细胞形态变化；可以采用灌注技术来替代细胞过滤系统，达到高密度培养细胞的目的；细胞可以更有效的表达同一产品；便于进行实验；细胞容易适应环境，适用细胞种类广[1]。

此方法的缺点有：传代和扩大培养困难，生产规模受限；操作麻烦，细胞取样和计数困难；传质和传氧差，测定和控制细胞同质性困难；传代换液容易污染；占用空间大。

转瓶培养是疫苗生产中较早期使用的贴壁培养技术。而后衍生出的多层平板培养系统以增加比表面积的方式实现细胞高密度培养，可控性好，产品质量均一。然而此方法培养的部分细胞不能被充分消化，长期培养会使死角处细胞堆积[2]。目前较热门的贴壁培养技术是生物反应器系统，其中较为常见的是固定床式生物反应器。此种方法培养的细胞规模大，密度高。

1.2悬浮培养

悬浮培养是细胞在培养液中呈悬浮状态生长繁殖的培养方法。

此方法的优点有：细胞无需适应，即可大量生长繁殖；细胞与培养液和气体可以充分接触，细胞收率高；可连续测定细胞浓度，便于定量研究；传质和传氧好，易于控制培养条件；传代无需消化分散，使细胞免受伤害；可在连续封闭系统中进行，减少受污染的机会；易于大规模生产。

此方法的缺点有：难以采用灌流培养，细胞密度低；适用细胞种类少（仅能适用于非贴壁细胞和兼性贴壁细胞）[3]。

悬浮培养方法有静置悬浮培养法、翻滚培养法、旋转培养法、旋摇培养法、电磁悬搅培养法、震荡培养法和滋养器装置培养，常用反应器为搅拌式生物反应器和气升式生物反应器。悬浮培养技术多用于重组蛋白和单克隆抗体生产。

1.3固定化培养

固定化培养是将细胞限制或固定在特定空间位置的培养技术。

此方法的优点有：适用细胞广；培养的细胞密度高；细胞损伤低；易更换培养液；易分离纯化。

此方法的缺点有：生产成本高；无确定的优化培养系统。

固定化培养方法主要有吸附法、包埋法、微载体细胞培养法、多空载体培养法、微囊化培养法和中空纤维培养法等。其中微载体细胞培养法、微囊化培养法和中空纤维培养法是目前比较成熟且有应用价值的大规模培养方法。

2　微载体悬浮培养技术介绍

微载体细胞培养法是将细胞吸附于微载体表面，在培养液中进行悬浮培养，是细胞在微载体表面长成单层的培养方法。

2.1微载体悬浮培养的优势

它结合了贴壁培养和悬浮培养的传统优势：使细胞贴附在微小颗粒载体上，创造了较大的面积供细胞贴附、生长、增殖，且载体小，比重轻，在轻度搅拌下即可使细胞悬浮于培养液中，增加细胞与培养液的比表面积；细胞所处环境均一且容易测量与监控；培养操作可系统化、自动化，降低了污染发生的机会；占用空间小；培养液利用率高；重复性好，放大容易。

2.2微载体悬浮培养的步骤及过程优化

微载体悬浮培养与一般的细胞培养一样需要经过接种、观察培养、计数、消化、分离和传代等几个步骤。然而，可以从以下几个方面对其进行优化，从而使通过微载体悬浮培养的细胞更有活力，密度更高。

2.2.1微载体的选择

现阶段的微载体主要分为固体微载体和液体微载体[4]。固体微载体包括实心球体微载体和大孔微载体。液体微载体是在搅拌过程中形成微珠，并使细胞贴壁生长，达到培养目的时停止搅拌，通过离心分相使细胞悬浮于有机相和培养液相之间。从材料上看，微载体的来源主要有早期的人工合成聚合物和现代的天然聚合物及其衍生物[5]。

我们所要选择的微载体应不含毒害细胞的物质且有很好的生物相容性，密度应略大于培养液，直径应尽可能小，且有较大的单位体积内表面积，利于细胞生长。另据研究，微载体表面的电荷密度是影响细胞贴壁的因素之一，过低的电荷密度使细胞贴壁不充分，而过高的电荷密度会“毒害”细胞。此外，优良的微载体还应是非刚性材料，具有良好的光学透性，不吸收培养液中的营养成分，易回收，耐高压灭菌，且价格低廉。在大规模培养之前，还应使用不同微载体对细胞进行小规模的预先培养，以确认不同微载体对特定细胞在细胞密度、培养寿命和产品表达上的影响。

2.2.2动物细胞系的选择及悬浮驯化

在细胞系的选择上，因为不同细胞以及同种细胞不同克隆株对病毒的易感性都不同，所以在大规模生产前应将细胞与准备扩增的病毒进行相互适应性选择[6]。此外，理想的细胞系还应是能够高速繁殖的活力较强的细胞。

在细胞系的驯化上，因为微载体悬浮培养会使贴壁细胞的生长状态产生变化，所以在驯化过程中，我们可以通过降低培养液中血清浓度的方式来提高细胞的稳定性。

3　研究进展

3.1微载体培养实验室研究进展

Jayakumar等使用Cultispher-G微载体培养Vero细胞制备狂犬疫苗，TCID50达106个/mL，高于同期转瓶培养效价。[7]李薇等使用Cytodex-3微载体在15L生物反应器中培养Vero细胞，细胞总数可达1.7×1010个，高于同期同体积转瓶培养细胞，接种乙脑病毒，效价达到7-7.5lgPFU/mL，可连续收获13-15次，均高于同期转瓶培养细胞[8]。王佃亮等使用Biosilon微载体在1.5L Celligen生物反应器中灌流培养Vero细胞，细胞密度可达2.05×107个/mL，接种疱疹性口炎病毒，证明细胞密度越高，效价越高[9]。韩宝三等用Cyto⁃dex-3微载体培养人骨髓间充质干细胞，证明微载体培养技术可以很好地扩增人骨髓间充质干细胞，且增殖活性高于同期单层聚苯乙烯培养的细胞[10]。吴清法等用Cultispher-G微载体培养人骨髓间充质干细胞，细胞密度和能量利用率均高于同期12孔板静止培养的细胞[11]。

3.2微载体大规模培养进展

Genzel等用生物反应器大规模培养MDCK细胞并接种马流感病毒，研究了细胞生长和病毒增殖过程中物质代谢情况，为工业化生产打下基础[12]。美国Baxter公司6000L生物反应器微载体悬浮培养Vero细胞已经能够生产人源或禽源的H1、H2、H3、H5、H7和H9毒株并对野生型人H5N1病毒有更高产率[13]。

在国内，采用生物反应器进行微载体悬浮培养的最大瓶颈是逐级放大技术的开发。清大天一与2011年成功实现10L-50L-120L-650L反应器逐级放大微载体悬浮培养MDCK细胞、Vero细胞、ST细胞等多种细胞[14]。张立等研究了微载体放大过程中的接种工艺并建立了球传球动力学模型，用此方法在50L生物反应器中培养Vero细胞，细胞密度达1.1×107个/mL[15]。

4　当前微载体悬浮培养技术所存在的问题及对其未来的展望

4.1微载体悬浮培养技术所存在的问题

微载体悬浮培养技术虽然经过多年研究而有了长足的进步，但在将其应用到细胞大规模培养的过程中依旧出现不少问题。

首先，通过生物反应器微载体悬浮培养细胞时，细胞生长会受到对剪切力的敏感性、营养供给阻碍、代谢产物堆积等多种因素影响而使得细胞活性和密度较低。此外，凋亡细胞不及时清除还可能造成细胞大面积死亡[16]。

其次，在细胞培养的过程中，随着细胞的增殖，需要及时增加微载体以供细胞黏附生长。但是,在实际生产过程中,添加微载体会给操作带来不便并增加产品污染的几率,且微载体不能无限增加,当微载体不能提供足够细胞生长所需的表面时,细胞生长便会受到抑制。

最后，由于大部分微载体价格高昂，使得对此项技术的大规模培养工艺探索变得困难，也使得将此技术在发展中国家推广遇到障碍。

4.2微载体培养的展望

在过去几十年时间里，应用微载体悬浮培养技术大规模培养细胞在疫苗生产领域已积累大量的实验数据。但是，在以下几方面微载体悬浮培养技术依旧有进步空间。

如前所述，理想化的微载体应是能满足避免细胞受机械力损伤，有良好生物相容性，无细胞毒性，价格低廉且易回收等诸多条件。但就目前的科研进展，并未出现能满足上述要求的微载体。所以，将来微载体的研究方向应是改良现有微载体，以满足细胞生长要求并便于推广此项技术。

除此之外，对现有的生物反应器进行优化和研发个性化的无血清培养基，以便将这种技术在细胞大规模培养领域进一步推广也是微载体悬浮培养未来的发展方向。

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王蔚曦（1988-)，女，江苏南京人，本科学历，助理工程师，从事疫苗制造工作。