水牛奶中优良乳酸菌的筛选及复合菌株发酵研究

文/马雨璇吴可非桑 跃葛绍阳张清海刘治麟赵 亮*（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京市高等学校畜产品工程研究中心；2北京农学院食品科学与营养工程学院，食品质量与安全北京实验室；科迪食品集团股份有限公司；北京和益源生物技术有限公司）



水牛奶中优良乳酸菌的筛选及复合菌株发酵研究

文/马雨璇1，2吴可非1，2桑 跃1葛绍阳1张清海3刘治麟4赵 亮1*
（1中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京市高等学校畜产品工程研究中心；2北京农学院食品科学与营养工程学院，食品质量与安全北京实验室；3科迪食品集团股份有限公司；4北京和益源生物技术有限公司）

摘 要：采用传统分离方法从水牛奶中分离得到50 株乳酸菌，其中22 株为乳球菌，28 株为乳杆菌。对所有菌株进行产酸性能评价，筛选了4 株性能较好的菌株：乳杆菌KDL22、KDL29，乳球菌KDS25、KDS27。将乳球菌和乳杆菌以1∶1比例进行组合，并对复合菌株的发酵性能进行了研究。结果表明，复合菌株在发酵过程中的产酸速度高于单菌，能在4 h内凝乳，且后酸化较弱，符合工业化发酵剂的要求。通过对4 种复合菌株发酵剂的后酸化能力、产双乙酰能力、蛋白质水解能力以及发酵乳的感官效果进行比较，最后得出KDL22+KDS25复合菌株发酵牛乳的效果最佳，可作为发酵剂用于酸乳的生产。

关键词：水牛奶；乳酸菌；复合菌株

乳酸菌被广泛应用于食品加工［1，2］。乳酸菌的分离与筛选是其应用的前提。我国是最早利用乳酸菌发酵食品的国家之一，有着丰富的传统发酵食品资源［3，4］。

乳酸菌的筛选因素主要包括乳酸菌的酸化能力、后酸化能力、产香味物质能力［5，6］。产酸能力是乳酸菌的重要性质，酸度是影响酸乳加工周期、生产效率及风味的一个重要质量指标，一般通过绘制酸乳在制作过程中酸度随时间变化的曲线来确定产酸能力的强弱［7］。酸乳的后酸化使酸乳产品在消费过程中酸度升高，导致消费者不可接受的过酸味及感官质量下降，严重影响酸乳产品的性质［8］。乳酸菌在乳中生长繁殖，除产生大量乳酸使乳凝固外，还会产生许多风味物质，主要有乙醛、丁二酮、双乙酰等，这些风味物质的含量和种类决定着产品的适口性［9］。乙醛是酸乳的主要风味物质，其含量决定了成品的风味，可以赋予酸乳理想的香味［9，10］，乙醛的浓度应该在10～40 μg/mL。另外，双乙酰会形成特征性的类似“奶油”的坚果仁香味［11］，也会大大改善酸乳的风味。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验原料

水牛奶，脱脂乳。

1.1.2 试剂及培养基

氢氧化钠、三氯乙酸、四硼酸钠、丝氨酸、邻苯二甲醛、99%二硫苏糖醇（DTT）等，均为分析纯；MRS培养基、M17培养基，均由实验室按参考文献［12］进行配制。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的采集

水牛奶样品置于无菌试管中，低温保存运输，24 h内处理。

1.2.2 乳酸菌的分离纯化

采用MRS培养基分离乳杆菌，M17培养基分离乳球菌。通过10 倍梯度稀释得到单克隆菌落，初步根据菌落形态，大小，颜色，培养基中生长位置（表面、内部、底部）挑取不同表观特征的菌落，并对得到的菌落进行培养。

1.2.3 菌株稳定性试验

将乳酸菌接种到液体培养基（乳杆菌使用MRS培养基，乳球菌使用M17培养基）中，37 ℃培养15 h后，以3%比例接种于灭菌脱脂乳中，43 ℃发酵，凝乳后记录凝乳时间；并将凝乳以3%比例继续接种于新鲜灭菌脱脂乳中，连续传代记录凝乳时间。

1.2.4 酸度和pH值的测定

采用浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液对发酵乳的酸度进行滴定，具体方法为：称取10 g左右样品，置于150 mL锥形瓶中，用40 mL新煮沸冷却到40 ℃的蒸馏水稀释均匀，然后滴加3 滴10 g/L酚酞溶液，用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定至微红，并在30 s内红色不消失，记录所用NaOH溶液的体积，计算滴定酸度（°T）。滴定酸度（°T）= V（0.1 moL/L的NaOH溶液体积，mL）/M（发酵乳的质量，g）×100。同时用pH计测定发酵乳的pH值。

1.2.5 双乙酰含量测定

取一定量的待测乳样，加入等体积的16%三氯乙酸溶液，混匀，4 °C下4 500 r/min离心10 min，取上清液过滤。向试管中移取滤液5 mL，加入0.5 mL 1%邻苯二胺溶液，于暗处反应30 min，然后向试管中加入4 mol/L的盐酸溶液1 mL，终止反应，测定335 nm处的吸光度值［13，14］，根据双乙酰标准曲线和样品的吸光度值，计算样品的双乙酰含量。

1.2.6 游离氨基酸含量测定

采用邻苯二甲醛法（OPA）测定游离氨基酸的含量。取0.45 mL发酵乳样于离心管中，加入0.75 mol/ L三氯乙酸溶液0.9 mL，室温静置反应10 min，4 °C下4 500 r/min离心15 min，取上清液0.15 mL，加入3 mL OPA试剂，测定340 nm处的吸光值，以丝氨酸为标准计算最终的游离氨基酸含量［15］。

2 试验结果与分析

2.1 乳酸菌的筛选结果与分析

以H2O2酶试验呈阴性、菌落乳白、革兰氏染色镜检观察G+球菌和杆菌，作为初步判定为乳酸菌的标准，共分离得到50 株乳酸茵，其中22 株为乳球菌，28 株为乳杆菌。

2.2 转接试验及发酵性能优良菌株的筛选

通过凝乳及稳定性试验，筛选出4 株乳酸菌（表1），这4 株乳酸菌发酵后凝乳性能好，稳定性良好，发酵乳组织状态、风味均较好。

表1　筛选出单菌株的凝乳情况

2.3 复合菌株发酵特性分析

将乳球菌与乳杆菌按照1∶1比例进行组合，形成4 株复合菌株，分别为KDL22+KDS25、KDL22+KDS27、KDL29+KDS25、KDL29+KDS27，测定复合菌株的产酸性能、后酸化性能、产香性能及蛋白质分解性能。

2.3.1 单菌株及复合菌株的产酸性能

将筛选出的发酵性能优良的4株菌株活化3 代，以3%接种量接种于脱脂乳中。同时将复合菌株以3%接种量接种于脱脂乳中，43 ℃发酵，每小时测定滴定酸度及pH值。从图1和2可以看出，KDL22单菌发酵酸度达到60 °T的时间在4 h以内，而其它3 株KDL29、KDS25及KDS27单菌所用时间均在6 h以上；除KDL29+KDS25外，其余复合菌株KDL29+KDS27、KDL22+KDS25及 KDL22+KDS27发酵酸度达到60 °T的时间均在4 h内，说明复合菌株初步满足发酵剂快速产酸的要求。

2.3.2 后酸化性能

4 种复合菌株的后酸化能力如图3所示，经过4 ℃冷藏3 周后，除KDL29+KDS27外，其它复合菌株的发酵乳酸度变化均在30 °T以内，说明后酸化较弱。4 ℃贮藏过程中酸度变化速度为：KDL22+KDS27 ＜KDL22+KDS25＜KDL29+KDS25 ＜KDL29+KDS27。

2.3.3 产香性能

图4展示了复合菌株发酵剂在发酵乳发酵及冷藏过程中双乙酰含量的变化趋势，除KDL29+KDS27外，其它3 株复合菌株发酵乳的双乙酰含量均在3 天内达到峰值，其中KDL22+KDS27复合菌株发酵乳的双乙酰含量最高。

2.3.4 蛋白质分解能力

从图5可以看出，发酵及冷藏过程中游离氨基酸的含量整体上呈上升趋势，且游离氨基酸各组之间无显著差异。

图1　单菌产酸曲线

图2　4种复合菌株产酸曲线

图3　4 ℃冷藏过程中4 种复合菌株发酵乳的酸度变化曲线

图4　4种复合菌株发酵乳的双乙酰含量变化曲线

3 结论

本研究从水牛奶中分离获得了50 株乳酸菌，并从单菌株产酸、凝乳性能方面筛选出4 株适合作为酸乳发酵剂的乳酸菌。将乳球菌和乳杆菌以1∶1比例进行组合后，发现复合菌株的产酸能力、凝乳效果比单菌株好，且后酸化弱。试验还分别测定了4 种复合菌株发酵乳在4 ℃冷藏过程中的产香能力和蛋白质水解能力，测得3 种复合菌株发酵乳的双乙酰含量在3 天内达到峰值；蛋白质水解产生的游离氨基酸呈上升趋势，且各组合之间未发现显著差异。KDL22+KDS25复合菌株发酵牛乳的效果最佳，可作为发酵剂用于酸乳的生产。

图5　4 种复合菌株发酵乳的游离氨基酸含量变化曲线

参考文献

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Screening for Potential Lactic Acid Bacteria for Excellent Yoghurt Starter

MA Yu-xuan1，2，WU Ke-fei1，2，SANG Yue1，GE Shao-yang1，ZHANG Qing-hai3，LIU Zhi-lin4，ZHAO Liang1*
（1 College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Higher Institution Engineering Research Center of Animal Product；2 College of Food Science and Technology，Beijing University of Agriculture，Beijing Laboratory for Food Quality and Safety；3 Kedi Group Company Limitid；4 Beijing Heyiyuan Biotechnology Company Limitid）

Abstract：Fifty strains of lactic acid bacteria were separated from buffalo milk，including twenty-two of Lactococcus and twenty-eight of Lactobacillus. KDL22，KDL29，KDS25 and KDS27 were selected based on the acidity and flavor test. The Lactococcus and Lactobacillus were mixed with the ratio of 1∶1 as a composite strain，and the fermentation performance of four composite strains were examined. The results showed that the composite strains had the better performance with higher acid production rate，and the clotting time could be as short as 4 h，as well as the post-acidification was not so strong. The composite strains could meet the standard of industrialization. The composite strain KDL22+KDS25 was the most excellent for yoghurt starter.

Key words：buffalo milk；lactic acid bacteria；composite strain

［基金项目：本研究受“奶牛产业技术体系北京市创新团队”“益生菌生产关键技术科技成果转化”项目支持。］

作者简介：

马雨璇（1994-），女，本科，研究方向为乳品微生物。

通讯作者：⋆赵亮（1983-），男，中国农业大学食品科学与营养工程学院副教授，主要从事益生菌科学技术研究。

收稿日期：（2016-04-10）