精子DNA损伤与男性精液常规质量参数的关系*

包华琼孙 岚伊宏亮 柴路维 杨学妞 丁 杰 蔡 敏

重庆市人口和计划生育科学技术研究院附属医院，重庆市出生缺陷与生殖健康重点实验室（重庆　400020）



精子DNA损伤与男性精液常规质量参数的关系*

包华琼△**孙 岚△伊宏亮 柴路维 杨学妞 丁 杰 蔡 敏

重庆市人口和计划生育科学技术研究院附属医院，重庆市出生缺陷与生殖健康重点实验室（重庆400020）

△共同第一作者

据报道， 近50年来男性精液质量持续下降，不育症的发病率越来越高，有10%的育龄夫妇患有不孕症，其中约50%是丈夫精液质量下降引起［1］。精液常规质量分析虽是男性生育能力的主要评估指标，但它在全面评价精子的受精能力等方面有一定局限性。近年来临床研究表明：在特发性不育中，有近20%的患者有高水平的精子DNA损伤［2］。这说明精子DNA损伤可能是男性不育的重要因素之一。本研究通过分析精子DNA损伤率与精液常规质量参数的相关性，探讨精子DNA损伤检测在男性不育诊治中的临床价值，为男性不育患者的诊断及治疗提供依据。

材料与方法

一、研究对象

所有精液标本于2012年5月至2014年12月在重庆计生医院生殖中心和西南医院生殖中心收集。随机选取296例不育男性为实验组，40例正常生育男性为对照组，分别对两组精液进行常规质量参数分析；用SCD法检测精子DNA损伤率，并根据损伤程度（DNA损伤率＜25%，≥25%）将296例不育男性分为两组。所有研究对象年龄在22～40岁，平均年龄（32.5±5.2）岁；无性功能障碍病史、无遗传性疾病家族史及外伤，体检未发现明显的附睾、睾丸及输精管异常；有隐睾症、无精子症、精索静脉曲张、腮腺炎病史患者已排除。

二、精液标本收集

所有精液收集和质量检查参照WHO第五版标准和操作程序［3 ，4］。男方禁欲2～7d，手淫法取全部精液于无菌取精杯中，置37℃水浴箱内液化后充分混匀，采用计算机辅助精液分析检测精液常规、动态及形态参数。

三、精子DNA损伤检测

精子DNA 损伤检测试剂盒购自深圳市博锐德生物科技有限公司。所有操作步骤参照试剂说明书进行。

1. 精子标本处理：新鲜精液行常规检查后稀释浓度为（5～10）×106/mL，取60μL 加入已熔化的易熔凝胶管中充分混匀，37℃孵育待用。

2. 变性处理：取30μL精子凝胶混合液包被于已预冷的载玻片上，置于2～8℃冰箱使其凝固，5min后小心移去盖玻片，将载玻片立即垂直浸入反应液A池，室温反应7min后，再将载玻片浸入反应液B池中反应25min；最后将载玻片水平浸入大量纯化水中洗涤1～2次，每次5min。

3. 脱水、染色：将变性处理后的载玻片依次置于70%、90% 和100% 的梯度乙醇中脱水，各2min。待干燥后用瑞氏染液覆盖，30s后缓慢加入瑞氏缓冲液，充分混匀。15min后流水冲洗，干燥备用。

4. 精子DNA损伤率计算：采用精子染色质扩散法（SCD）检测原理，根据光晕的有无和大小判断精子DNA损伤程度，显微镜下计数500个精子。计算公式为：精子DNA损伤率（%）=存在DNA损伤精子数/被观察精子总数×100%。精子DNA损伤率＜25%记为正常。

四、统计学分析

用 SPASS17.0统计软件进行分析，所有计量资料用（x±s）表示，行t检验；相关性分析采用Spearman法。

结　果

一、实验组与对照组精液参数比较

与对照组相比，实验组不育男性精子DNA损伤率显著升高，而前向运动精子率、精子活动率显著降低（P＜0.05）。两组之间年龄、精液量、精子浓度、精子总数、精子正常形态率也有一定差异，但无统计学意义（P＞0.05），（见表1）。

表1　实验组与对照组各项精液参数比较（±s）

表1　实验组与对照组各项精液参数比较（±s）

*与对照组相比，P＜0.05

项目　　对照组（n=40）　　实验组（n=296）年龄（岁）　33.5±5.5　32.4±4.9精液量（mL）　3.8±1.5　3.2±1.2精液浓度（×106/mL）　65.1±31.4　58.7±39.3精子总数（×106）　238.9±153.4　200.9±132.6前向运动精子（%）　47.9±14.8　26.5±14.3*精子活动率（%）　68.6±10.7　42.2±12.7*精子正常形态率（%）　10.7±5.3　8.2±2.7精子DNA损伤率（%）　10.2±2.4　19.6±3.7*

二、精子DNA损伤程度与精子常规质量参数的关系

296例不育男性中，按精子DNA损伤程度（DNA损伤率＜25%，≥25%）分为两组。与＜25%组比较，≥25%组中男方的前向运动精子率、正常形态率明显降低（P＜0.05）；两组之间年龄、精液量、精子浓度、精子总数、精子活动率也有一定差异，但无统计学意义（P＞0.05），（见表2）。

表2　精子DNA损伤程度与精子常规质量参数的关系

三、精子DNA碎片率与精子常规质量参数相关性分析

Spearman相关性分析结果显示：精子 DNA 损伤率与男方年龄呈正相关；与前向运动精子率、正常形态率呈负相关（P＜0.05），（见表3）。

表3　精子DNA损伤率与精子常规质量参数相关性分析

讨　论

精液常规检查是传统诊断男性不育第一参考指标，但有其局限性［4］。临床研究发现：男性不育患者中有15%左右显示精液常规质量参数正常。近年来，精子DNA损伤作为一项新的评价精子功能的指标，已逐渐应用于男性不育症的诊疗和研究中。精子DNA损伤会引起精子功能和受精能力下降，导致不孕不育［5， 14］。

在精子形成过程中，染色质的核蛋白经历了从组蛋白-过渡蛋白-鱼精蛋白的转变，以维持精子DNA的完整性。本实验结果表明：与对照组相比，实验组不育男性的精子DNA损伤率显著升高，而前向运动精子率、精子活动率显著降低（P＜0.05）。这与Rybar［6］、Blumer等［7］的报道相一致。当鱼精蛋白合成缺陷或功能异常时，会造成精子染色质浓缩过程异常，形成结构松散的染色质，引起精子DNA损伤［8， 15］。而这一系列的改变会直接导致精子线粒体功能损伤，从而引起前向运动精子率减低，精子活力下降，引发男性不育［9］。另一方面，可能是由于精液中存在异常增多的白细胞可诱导精子产生过量的氧自由基，损伤精子膜的流动性和完整性，导致精子核DNA变性或断裂，从而破坏精子功能［10］。综上所述，精子DNA 损伤可使精子的运动能力下降，活力降低，影响精子与卵子的结合，最终导致不育。

此外，本研究还发现：当精子DNA损伤率≥25%时，前向运动精子率、正常形态率均明显降低（P＜0.05）；且相关性分析显示，精子DNA损伤率与前向运动精子率、正常形态率呈负相关。这首先可能是因为在未成熟精子和畸形精子的细胞核内含有大量的组蛋白，使得鱼精蛋白含量降低，与DNA结合疏松，导致精子DNA损伤，活动率下降。其次，精子形态与氧化应激反应相关［11， 12］。精液中的畸形精子是过量活性氧的主要来源，它们引发的氧化应激反应可导致精子DNA完整性损伤进而产生更多的畸形精子，而这些畸形精子又会相应的加重精子DNA的损伤。两者之间相互影响，形成恶性循环。

另外，本研究中显示精子DNA损伤率与男性年龄呈正相关。这提示随着年龄的增长，由于氧化应激或精子凋亡机制减退等原因，使得其自身无法有效清除DNA受损的精子［2， 13］。这可能是35岁以上男性生育能力逐渐下降的原因之一。

总之，精子DNA损伤检测能够揭示精子染色质浓缩程度和精子成熟度等细微异常。将其作为精液常规质量分析的补充，并结合其他精子功能指标，更能全面客观地评估男性生育力，这将对男性不育的病因学及治疗方法产生深远的理论意义和临床实用价值。

关键词精子； DNA损伤； 精液常规； 不育，男性

doi∶10.3969/j.issn.1008-0848.2016.02.012

参 考 文 献

1 Chen SS ， Huang WJ. Differences in biochemical markers

and body mass index between patients with and without varicocele. Chin Med Assoc 2010； 73（4）∶ 194-198

2曾兰， 叶飞， 李运星， 等. 精子DNA完整性与精液常规参数相关性分析. 中国计划生育和妇产科 2014； 6（4）∶ 47-50

3谷翊群， 陈振文， 卢文红， 等. 人类精液检查与处理实验室手册（第五版）. 北京∶ 人民卫生出版社， 2011∶ 10-35

4曹小蓉， 闫峰， 平萍， 等. 人类精子库档案信息管理系统及临床应用. 中国男科学杂志 2011；25（12）∶38-41

5陈俊清， 罗胜萍， 黄诚刚. 精浆活性氧水平与男性不育的相关性研究. 国际检验医学杂志 2011； 32（9）∶ 1002-1004

6Rybar R， Markova P， Veznik Z， et al. Sperm chromatin integrity in young men with no experiences of infertility and men from idiopathic infertility couples. Andrologia 2009； 41（3）∶ 141-149

7Blumer CG， Fariello RM， Restelli AE， et al. Sperm nuclear DNA fragmentation and mitochondrial activity in men with varicocele. Fertil Steril 2008； 90（5）∶ 1716-1722

8张欢， 郑屹， 郑九嘉， 等. 精子核蛋白组型转换对精子DNA损伤程度和精液参数的影响. 中国男科学杂志2015； 24（6）∶ 24-29

9陆杉， 倪运萍， 刘娟， 等. 前向运动精子数量对男性因素不孕者宫腔内人工授精临床妊娠率的影响. 重庆医学2014； 23（8）∶ 2991-2993

10徐志鹏， 孙海翔， 张宁媛. 精子 DNA 损伤与辅助生殖技术. 中华男科学杂志 2008； 14（3）∶ 259-263

11张洲， 师娟子， 邢俊平， 等. 复发性流产与精液常规参数、精子畸形率和DNA完整性的相关性. 第三军医大学学报 2010； 32（16）∶ 1788-1792

12Hauser R， Meeker JD， Singh NP， et al. DNA damage in human sperm is related to urinary levels of phthalate monoester and oxidative metabolites. Hum Reprod 2007；22（3）∶ 688-695

13Sakkas D， Alvarez JG. Sperm DNA fragmentation∶mechanisms of origin， impact on reproductive outcome，and analysis. Fertil Steril 2010； 93（4）∶ 1027-1036

14Osman A， Alsomait H， Seshadri， et al. Does the extent of sperm DNA fragmentation affect IVF or ICSI outcome∶a systematic review and meta analysis. Hum Reprod 2013；28 （supp 1）∶ i9-i12

15谷龙杰， 陈振文， 许剑锋. 不育男性精子染色质结构与精液常规参数的关系. 中国男科学杂志 2009； 23（3）∶ 29-32

（2015-08-10收稿）

*基金项目资助：重庆市科技攻关重点项目（cstc，2013ggB00001）；重庆市基本科研业务费项目（2013cstc-jbky-01707）

中图分类号R 321.33

**通讯作者，E-mail：baohuaqiong@163.com