2010—2014年山东H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及HA和NA基因序列分析

王冬冬，张　毅，侯广宇，刘永举，刘　朔，蒋文明，李金平，于建敏，范丹丹，陈文雅，王守春，尹燕博*，陈继明*

(1.青岛农业大学动物科技学院，青岛 266109；2.中国动物卫生与流行病学中心，青岛 266032；3.青岛农业大学生命科学学院，青岛 266109；4.青岛澳兰百特生物工程有限公司，青岛 266101)



2010
—2014年山东H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及HA和NA基因序列分析

王冬冬1，2，张毅2，侯广宇2，刘永举3，刘朔2，蒋文明2，李金平2，于建敏2，范丹丹1，陈文雅4，王守春4，尹燕博1*，陈继明2*

(1.青岛农业大学动物科技学院，青岛 266109；2.中国动物卫生与流行病学中心，青岛 266032；3.青岛农业大学生命科学学院，青岛 266109；4.青岛澳兰百特生物工程有限公司，青岛 266101)

摘要：旨在了解山东地区H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的流行和遗传变异情况，为该地区H9N2亚型禽流感的防制提供依据。通过鸡胚接种的方法从山东省分离到1 296株H9N2 AIV，并选取40株对其进行HA和NA基因的扩增、测序及遗传进化分析。结果显示，2013年H9N2 AIV的分离率最高，达42.30%；40株病毒的HA和NA的核苷酸序列同源性及推导的氨基酸相似性均在90%以上；HA裂解位点序列为PSRSSR↓GLF，NA颈部缺失3个氨基酸；HA和NA均存在糖基化位点的缺失和新的糖基化位点出现；大部分毒株发生了易于感染人型受体的突变；演化分析表明40株病毒的HA和NA基因均属于Y280-like亚分支。结果提示，H9N2 AIV在山东省各地区普遍流行且在2013年达到高峰，所有毒株均符合低致病性禽流感病毒的分子特征，并且具有结合哺乳动物唾液腺受体的能力，因此应密切关注H9N2病原出现的新变化，制定相应的防控措施。

关键词：H9N2；禽流感病毒；HA；NA；序列分析

禽流感(avian influenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒属禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)引起的禽类的一种传染病。AIV亚型众多，其中H9N2 AIV自1994年由陈伯伦等首次从中国大陆分离至今，已在我国持续流行，且宿主范围广泛，包括鸡、鸭、珍珠鸡、鹌鹑等[1]。H9N2 AIV已成为制约养禽业发展的重要因素，是我国现有AIV的主要亚型[2]。

AIV基因组分为8节段，至少翻译11种蛋白质，其中HA和NA为两种主要的表面糖蛋白，在流感病毒致病力、宿主特异性等方面起重要作用[3-10]。HA基因和NA基因的变异性强，是导致病毒抗原变异的主要原因，最能反映流感病毒的变异程度。因此监测HA与NA基因的进化，调查HA与NA基因的变异情况至关重要。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1病料和鸡胚病料来源于2010—2014年山东部分地区送检的病鸡或病变的肺、气管等组织；SPF鸡胚购自山东SPF鸡实验种鸡场，由本实验室孵化至10日龄。

1.1.2标准抗原和阳性血清AIV、新城疫病毒(NDV)等抗血清由中国动物卫生与流行病学中心馈赠。

1.1.3主要试剂RNAiso Plus试剂、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit(cat.#RR055A)购自宝生物工程(大连)有限公司；无水乙醇、异丙醇、三氯甲烷等均为国产分析纯。1.1.4引物设计与合成HA、NA基因全长扩增引物参考E.Hoffmann等[10]的研究，引物序列见表1；引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。1.1.5主要生物学软件Lasergene 7软件包 (DNASTAR，Madison，WI，USA)，MEGA 6软件(http：//www.megasoftware.net/)，在线工具BLAST(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，在线工具NetNGlyc 1.0 Server (http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)。

表1HA和NA全长基因扩增引物

Table 1Primer set used for RT-PCR amplification ofHAandNAgene

基因Gene引物序列Primer(5'-3')产物长度/bpExpectedsizeHAF:TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGGR:ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT1778+29NAF:TATTGGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGTR:ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT1413+29

1.2病毒分离与鉴定

将样品除菌后经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚分离病毒，每天观察鸡胚存活情况，并于72 h无菌收获鸡胚尿囊液，放至-80 ℃冰箱备用。收获的尿囊液经血凝(HA)、血凝抑制(HI)以及RT-PCR检测鉴定。在所分离鉴定的H9N2 AIV中，每年选取8株(共计40株)不同地区的病毒进行HA和NA基因全长的测序分析。

1.3核酸提取及扩增

核酸提取参考RNAiso Plus试剂说明书进行。核酸样品冻存于-80 ℃冰箱备用。参考PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit说明书进行HA和NA基因全长的扩增。

1.4基因序列分析

基因扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。并通过测序峰图及序列比对分析排除由RT-PCR扩增引起的突变。使用SeqMan等软件对测序获得的序列进行处理，使用EditSeq软件进行核苷酸翻译，使用MegAlign计算核酸及蛋白质序列的同源性，通过在线软件NetNGlyc 1.0 Server进行糖基化位点预测。

1.5系统发育分析

从GenBank下载已报道的9株H9N2 AIV的HA和NA的基因序列作为参考，使用最大似然法(maximum likelihood)建立系统发育树。建树前，使用MEGA 6中的Muscle程序对建树序列基于密码子(codons)方式进行多重序列比对，利用Find Best DNA Models选择最优化的核苷酸替换模型，并参照BIC(Bayesian information criterion)标准设置相应参数，自举值(bootstrap)设置为1 000。

2结果

2.1病毒的分离鉴定

2010—2014年间，本实验室共检测病料5 629份(2010年1 055份，2011年2 177份，2012年737份，2013年688份，2014年972份)，通过鸡胚接种分离到H9N2 AIV 1 296株(2010年223株，2011年476株，2012年161株，2013年291株，2014年145株)，H9N2 AIV的年分离率分别为21.14%、21.86%、21.85%、42.30%和14.92%，每年各月份的病毒分离情况如图1所示。

图1　2010—2014年H9N2亚型禽流感病毒分离率Fig.1　Isolation rates of H9N2 avian influenza viruses during 2010-2014

2.2基因序列分析

将挑选的40株H9N2 AIV进行HA和NA基因的扩增和测序。序列分析显示，HA基因的核苷酸相似性为92.60%～100%，推导的氨基酸相似性为94.86%～100%；仅C/SD/LX294/10毒株在HA蛋白裂解位点序为PSRSSR↓GIF，其余毒株均为PSRSSR↓GLF；C/SD/PL135/13毒株和C/SD/LY554/10毒株在HA蛋白的145 aa处出现一个新的糖基化位点，C/SD/PL135/13毒株在313 aa和218 aa处各缺失1个糖基化位点，有7株病毒(C/SD/YT818/14、C/SD/WF631/14、C/SD/ZC635/13、C/SD/WF345/12、C/SD/LX242/12、C/SD/GM814/12和C/SD/LC750/13)在HA蛋白的218 aa处缺失1个糖基化位点；C/SD/PL135/13毒株在HA核苷酸序列的703—705位缺失3个碱基；测序毒株均有Q226L、S138A、I155T和H183N突变，90.0%(36/40)的毒株存在T160A突变，87.5%(35/40)的毒株存在A190V突变，这些位点的突变均与唾液腺受体结合特异性相关[1]。NA基因的核苷酸相似性为91.10%～100%，推导的氨基酸相似性为91.96%～100%；测序毒株均在NA蛋白的63—65 aa处缺失3个氨基酸；C/SD/PL135/13在NA蛋白143 aa处出现一新糖基化位点，C/SD/LX823/14毒株在234 aa处缺失1个糖基化位点。

2.3HA和NA基因进化分析

应用MEGA 6中Find Best DNA Models选择最优化的HA和NA基因核苷酸替换模型分别为HKY+G+I和TN92+G+I，根据模型将参考序列与所测序列构建最大似然树(图2)。40株病毒的HA基因属于欧亚系C/BJ/1/94分支，并且与D/HK/Y280/97的相似性达89.05%以上，属于Y280分支；NA基因同样属于C/BJ/1/94分支，与D/HK/Y280/97的相似性达90.77%以上，属于Y280分支。

图2　HA与NA基因系统进化树Fig.2　Phylogenic tree of HA and NA gene

3讨论

通过本实验室对山东地区送检病料的H9N2 AIV分离情况可以看出，山东地区H9N2 AIV普遍流行，并在2013年达到峰值；病毒在春冬季节分离率较高，但在较少报道流感发生的温暖月份(7—9月)也有病毒的分离。

基因序列分析显示，绝大多数毒株的HA裂解位点为PSRSSR↓GLF，属于低致病性毒株的特征。40株病毒的NA蛋白颈部均缺失3个氨基酸，这会增强NA蛋白酶的活性以及从红细胞释放的能力，同时NA颈部缺失的条件下，HA蛋白序列的316 aa处(即裂解位点前第5个氨基酸)A→S的突变可增强HA的裂解效率[3]。2株病毒在HA蛋白145 aa出现S→N的突变，造成145—147 aa多出1个糖基化位点，该位点的出现使得毒株的毒力增强和免疫原性的改变[4]。40株病毒蛋白质序列均存在与唾液腺受体结合特异性相关位点的突变，显示与哺乳动物唾液腺受体结合增强的特点，这类毒株的流行在公共卫生上值得关注。关于HA基因的核苷酸序列在703—705处缺失3个碱基是否影响毒株生物学性状等还需进一步研究。

HA和NA基因系统进化分析显示，病毒在不断进化，几乎每年都形成小的亚分支，但仍属BJ/94-like分支中的Y280-like亚分支，与国内其他学者的研究报道相一致，提示山东省H9N2 AIV可能处于一个比较稳定的遗传进化过程。

H9N2 AIV不仅在家禽中广泛流行，且已通过多种变异机制获得对新宿主适应能力，可感染鼠、猪、犬等哺乳动物以及人类，对公共卫生健康构成巨大威胁。H9N2 AIV为H5N1、H7N9、H10N8等造成人类死亡的流感病毒提供内部基因，提示加强对H9N2 AIV的监测显得尤为重要。

4结论

山东省各地区普遍流行H9N2 AIV，并且在2013年达到高峰。40株病毒蛋白质序列均显示与哺乳动物唾液腺受体结合增强的特点，但HA蛋白裂解位点序列仍符合低致病性禽流感病毒的分子特征。山东省H9N2 AIV在不断进化，但仍属于Y280-like亚分支，处于比较稳定的遗传进化过程。

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(编辑白永平)

Virus Isolation and Genetic Analysis of HA and NA Genes of H9N2 AIVs Isolated from Shandong Province from 2010 to 2014

WANG Dong-dong1，2，ZHANG Yi2，HOU Guang-yu2，LIU Yong-ju3，LIU Shuo2，JIANG Wen-ming2，LI Jin-ping2，YU Jian-min2，FAN Dan-dan1，CHEN Wen-ya4，WANG Shou-chun4，YIN Yan-bo1*，CHEN Ji-ming2*

(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao266019，China；2.ChinaAnimalHealthandEpidemiologyCenter，Qingdao266032，China；3.CollegeofLifeScience，QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao266019，China；4.QingdaoOland-BetterBioengineeringCo.，LTD.，Qingdao266101，China)

Abstract:In order to explore the epidemiological and genetic character of the H9N2 viruses，a long-term surveillance have been conducted in Shandong province.One thousand two hundred and ninety six strains of H9N2 virus were isolated from clinical samples，which were collected in chicken farms and LBMs，and theHAandNAgenes of 40 strains selected were amplified and sequenced.TheHAandNAgenes of these viruses shared more than 90% identity at the nucleotide level and amino acid level；most viruses carried the amino acid sequence PSRSSR↓GLF at the HA cleavage site and a 3-amino-acid deletion in the NA stalk；new potential N-glycosylation sites were found in the HA and NA in some viruses；the Q226L (H3 numbering) mutation was detected in all viruses at the receptor-binding pocket of HA；phylogenetic analysis showed that the HA and NA belong to the Y280-like sublineage.The H9N2 influenza virus was widely circulating in poultry farms of Shandong province，and reached peak in 2013；all of isolates preferentially bound to the human-like receptor，but still have the characteristic of low-pathogenic AIV.So，keeping monitoring and controlling H9N2 virus is necessary.

Key words:H9N2；avian influenza virus；HA；NA；sequences analysis

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.027

收稿日期：2015-09-30

基金项目：国家自然科学基金(31272535)；山东省现代农业产业技术体系家禽创新团队建设项目(SDAIT-13-011-03)

作者简介：王冬冬(1990-)，男，山东安丘人，硕士，兽医师，主要从事预防兽医学研究，E-mail: wdd20093246@163.com *通信作者：尹燕博，E-mail: yanboyin2011@163.com；陈继明，E-mail: chenjiming@cahec.com

中图分类号：S852.659.5

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)04-0852-05