穆箫吟,刘莉
(1.贵州省医药(集团)有限责任公司 科技部,贵州 贵阳 550000;2.贵州省第三人民医院 药剂科,贵州 贵阳 550000)
一测多评法同时测定舒血宁注射液中4种内酯含量
穆箫吟1Δ,刘莉2
(1.贵州省医药(集团)有限责任公司 科技部,贵州 贵阳 550000;2.贵州省第三人民医院 药剂科,贵州 贵阳 550000)
目的 采用“一测多评”法同时测定舒血宁注射液中4种内酯成分(白果内酯与银杏内酯A、B、C)的含量,并考察其方法学。方法 以白果内酯为内参物,建立舒血宁注射液中白果内酯与银杏内酯A、B、C间的相对校正因子;采用外标法测定舒血宁注射液中白果内酯的含量,通过相对校正因子计算舒血宁注射液中银杏内酯A、B、C的含量,并将用“一测多评”法测定的5批舒血宁注射液含量的结果与用外标法测定的结果进行t检验。结果 在一定的线性范围内,白果内酯与银杏内酯A、B、C的相对校正因子分别为:2.280、1.659、1.429,且在不同的实验条件下重现性良好;5批舒血宁注射液的“一测多评”法计算值与外标法测定值经t检验,差异无统计学意义;实验所得的校正因子可信。结论 本实验所建立的校正因子重复性良好,可用于舒血宁注射液中多个成分的定量分析与质量评价。
一测多评;舒血宁注射液;相对校正因子;内酯;内参物;外标法
舒血宁注射液是由银杏叶提取物制备的灭菌水溶液,其有效成分主要为黄酮苷类、萜类内酯活性物质,包括槲皮素、山奈酚、异鼠李素、白果内酯、银杏内酯等。现代研究表明其具有扩张心脑血管,改善微循环、提高机体缺氧耐受力、保护神经细胞、拮抗血小板活化因子、降低血液黏度、抗血栓、抗氧化、抗病毒等药理作用。临床上被广泛应用于心脑血管疾病、糖尿病并发症等疾病的治疗,具有较好的疗效[1]。关于舒血宁注射液含量测定方面的研究已有文献报道[2],但由于中药对照品昂贵、不易得等原因限制了含量测定方法的推广使用。本实验以舒血宁注射液中的白果内酯为内参物,建立白果内酯与银杏内酯A、B、C间的相对校正因子,实现用“一测多评”法同步测定舒血宁注射液中4种成分的含量。
一测多评法是指利用中药有效成分内在函数关系和比例关系,只测定一个成分实现多个成分的同步测定[3],该方法是通过建立成分之间的相对校正因子来对多个成分进行定量检测,因而校正因子在不同仪器、不同实验条件下的重现性如何是“一测多评”法定量是否准确的关键。“一测多评”法的另一个关键因素是成分色谱峰的定位方法,常用的色谱峰定位方法有“相对保留时间定位法”和“保留时间差定位法”。
本实验考察了所建立的相对校正因子在不同仪器及不同实验条件下的重现性,并采用“相对保留时间定位法”对各待测成分的色谱峰进行了定位;最后,将用“一测多评”法测定的5批舒血宁注射液含量的结果与用HPLC外标法测定的结果进行了t检验,对将“一测多评”法应用于舒血宁注射液多组分的含量测定进行了较为全面的考察。
1.1 材料
1.1.1 药品与试剂:舒血宁注射液(通化谷红制药有限公司,国药准字Z22026296,规格:5 mL/支,批号:141107/1、150307/2、150511/1、150615/2、150809/2);白果内酯对照品(批号:110865 - 200303)、银杏内酯A、B、C对照品(批号:110862-200305、110863-200204、110864 - 200203)均购自中国药品生物制品检定研究院。甲醇、四氢呋喃为色谱纯,水为超纯水,其他试剂为分析纯。
1.1.2 仪器:Aglient1100高效液相色谱系统(蒸发光散射检测器),色谱柱分别为:Dikxna Cl8(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Hypersil ODS C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)、Luna C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)、Agilent C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)。AB135S型电子天平(梅特勒-托利多)。
1.2 方法
1.2.1 溶液的配制:①混合对照品溶液:精密称取银杏内酯A、B、C及白果内酯对照品适量,加丙酮制成每1 mL分别含银杏内酯A、B、C 和白果内酯0.1、0.05、0.1、0.25 mg的对照品混合溶液,即得。
② 供试品溶液:取舒血宁注射液10支(5 mL/支),混匀,精取25 mL,加稀盐酸调节pH值至2.0,然后用乙酸乙酯提取4次(80、40、40、40 mL),合并乙酸乙酯液,用5%的醋酸钠溶液80 mL洗涤,分离出乙酸乙酯层,醋酸钠溶液再用乙酸乙酯40 mL洗涤,合并乙酸乙酯液及洗涤液,用水洗涤2次,每次80 mL,分离乙酸乙酯液,蒸干,残渣加丙酮适量溶解,并转移至2 mL量瓶中,加丙酮稀释至刻度,摇匀,用0.45 μm滤膜过滤,取续滤液即得。
1.2.2 色谱条件[2]:色谱柱:Dikxna Cl8(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:四氢呋喃-甲醇-水(10:20:75);流速:1.0 mL/min;蒸发光散射检测器;以空气为载气,流速3 L/min;漂移管温度:105 ℃;柱温:40 ℃。
在上述色谱条件下,取混合对照品溶液及供试品溶液各10 μL,记录色谱图。
1.2.3 一测多评方法学考察:
① 线性关系的考察:精密量取1.2.1项下银杏内酯混合对照品溶液2、5、8、10、15、20 μL,按1.2.2项下的色谱条件进样分析,以对照品进样量(X, μg)为横坐标,相应的峰面积值(Y)为纵坐标,进行线性回归。
② 校正因子的计算:以白果内酯为内参物,在2个不同的实验室间分别对银杏内酯A、B、C的校正因子进行复核计算,公式如下[4]。
fk/m= fk/ fm=(Wk×Am)/ (Wm×Ak)
Ak:内参物峰面积,Wk:内参物浓度;Am:其他组分m峰面积,Wm:其他组分m浓度。
③ 精密度试验:分别精取1.2.1项下①的银杏内酯对照品溶液,按1.2.2项下色谱条件,连续进样6次,每次10 μL,记录各成分的色谱峰面积。
④ 稳定性试验:精密吸取同一舒血宁注射液供试品溶液10 μL,室温放置,按1.2.2项下色谱条件,分别在0、2、4、6、 8、24 h进样10 μL,记录色谱峰面积,考察其溶液稳定性。
⑤ 重复性试验:精密吸取同一舒血宁注射液供试品溶液6份,每份10 μL,按1.2.2项下色谱条件进样分析,记录峰面积。
⑥ 加样回收试验:取已知含量的舒血宁注射液样品(141107/1)9份,3份为1组,分别加入约相当于样品含量50 %、100 %、150 %的银杏内酯A、B、C及白果内酯对照品,照1.2.1银杏内酯项下处理方法制备供试溶液,精密吸取该供试溶液10 μL,按上述色谱条件进样分析,计算加样回收率。
1.2.4 校正因子重现性的考察及各组分色谱峰的定位
① 不同仪器及色谱柱对相对校正因子的影响:本实验考察了不同仪器和不同色谱柱对相对校对因子的影响,方法按上述色谱条件进样分析。
② 不同柱温对相对校正因子的影响:实验在不同的实验室进行,采用岛津LC20A高效液相色谱系统、Dikxna Cl8色谱柱分别考察了不同柱温对相对校正因子的影响。
③ 不同流速对相对校正因子的影响:实验在同一实验室进行,采用岛津LC20A高效液相色谱系统、Dikxna C18色谱柱分别考察了不同的流速对相对校正因子的影响。
1.2.5 待测组分色谱峰的定位:由相关文献[4-6]可知,在色谱峰的定位方法选择上,相对保留时间定位法优于保留时间差定位法,相对保留时间定位法在一测多评中使用更为广泛。本实验分别考察了采用不同的色谱仪及色谱柱时,银杏内酯A、B、C色谱峰与白果内酯色谱峰的相对保留时间。
1.2.6 一测多评法与外标法测定结果的比较:实验采用一测多评法和外标法对5批舒血宁注射液的含量进行了检测,取舒血宁注射液5批(通化谷红制药有限公司,规格:5 mL/支,批号:141107/1、150307/2、150511/1、150615/2、150809/2),照“1.2.1”项下方法处理,“1.2.2”项下色谱条件进样,分别采用外标法和“一测多评法”计算舒血宁注射液中各组分的含量,并对测定结果进行t检验,证明2种方法差异无统计学意义。
2.1 一测多评方法学考察结果
2.1.1 回归方程及线性范围:各组分的色谱图见图1、图2;回归方程及线性范围见表1。
图1 总内酯混合对照品色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of total lactones mixed reference substances
图2 供试品色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of sample
2.1.2 校正因子的计算结果:2个实验室间的差异较小(RSD<1.0%),见表2。
表2 不同实验室测得的相对校正因子(银杏总内酯)
2.1.3 精密度试验结果:银杏内酯A、B、C及白果内酯峰面积的RSD分别为0.3 %、0.2 %、0.5 %及0.6 %, 表明仪器的精密度良好。
2.1.4 稳定性试验结果:银杏内酯A、B、C及白果内酯峰面积的RSD分别为0. 9 %、0.7 %、1.2 %及1.5 %,表明舒血宁注射液供试品溶液在24 h内基本稳定。
2.1.5 重复性试验结果:银杏内酯A、B、C及白果内酯峰面积的RSD分别为0. 3 %、0.5 %、0.2 %及0.3 %,表明该方法重复性较好。
2.1.6 加样回收试验:加样回收试验结果见表3。
表3 4种银杏总内酯类成分的加样回收率结果(n=9)
2.2 校正因子重现性的考察及各组分色谱峰的定位
2.2.1 不同仪器及色谱柱对校正因子的影响:结果表明不同仪器和不同色谱柱所得的相对校正因子差异性较小(RSD<0.5 %),见表4。
表4 不同仪器及色谱柱RCF耐用性考察(银杏总内酯)
2.2.2 不同柱温对相对校正因子的影响:结果表明柱温对相对校正因子的影响不显著(RSD<0.5 %),见表5。
表5 不同柱温RCF耐用性考察(银杏总内酯)
2.2.3 不同流速对相对校正因子的影响:结果表明不同的流速对相对校正因子的影响RSD<0.5 %,见表6。
表6 不同流速RCF耐用性考察(银杏总内酯)
2.3 待测组分色谱峰的定位 结果表明,不同色谱仪及色谱柱所测得的各成分相对保留时间差异无显著性意义(RSD<0.5 %),见表7。
表7 不同色谱仪及色谱柱相对保留时间(银杏总内酯)
2.4 一测多评法与外标法测定结果的比较:结果表明2种方法差异无统计学意义,见表8。
表8 不同批次样品的含量测定(n=5)
3.1 一测多评法的色谱峰的定位 中药的化学成分非常复杂,在不同的色谱系统中会有不同的色谱峰,在同一色谱系统中,其色谱峰的数量、出峰时间及峰形等也受到色谱柱、仪器、溶剂、柱温等诸多因素的影响,因此,待测成分色谱峰的定位至关重要。对于在一定的色谱条件下,色谱峰相对较少的中药,可根据《中药注射剂色谱指纹图谱研究的技术要求(暂行)》[7]推荐的相对保留时间对各组分的色谱峰进行定位。本实验采取该方法定位,相对保留时间在不同的色谱系统及色谱柱条件下重现性较好(RSD<0.5 %)。
3.2 “一测多评”法内参物的选择 实验选择白果内酯作为内参物,因为该成分在舒血宁注射液中含量较高,且性质稳定[8]。
3.3 检测方法的选择 根据相关文献资料,银杏萜类内酯含量测定方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法、示差检测法、ELSD法等。由于萜类内酯在紫外区吸收较弱,极少量的黄酮杂质将会严重干扰检测,使用紫外检测器检测较为困难,而示差检测器灵敏度、稳定性和选择性相对较差。本文参考有相关文献[2],选择蒸发光散射检测器对舒血宁注射液中的4种萜类内酯成分进行检测,灵敏度高,稳定性好,方法专属性强。
[1] 胡书佑.舒血宁注射液的临床应用与安全用药[J].湖南中医药大学学报,2012,32(11):78-81.
[2]王京辉,杜小伟,王萌萌,等. HPLC_ELSD法测定舒血宁注射液中萜类内酯含量[J].药物分析杂志,2009,29(1):76-78.
[3]王智民,高慧敏,付雪涛,等.“一测多评”法中药质量评价模式方法学研究[J]. 中国中药杂志,2006,31(23):1925-1928.
[4]付滢舟,冯有龙,曹玲,等.一测多评法测定速效救心丸中冰片的含量[J].药物分析杂志,2012,32(5): 775-778.
[5]黄帅,马淼,黄倩倩,等.一测多评法同步测定柴胡药材中3种皂苷的含量[J].时珍国医国药,2010,21(4): 838-840.
[6]李玲,赵顺,罗疆南,等.一测多评法测定胃苏颗粒中4种成分的含量[J].药物分析杂志,2015;35(4):751-757.
[7]国家药品监督管理局.关于印发《中药注射剂色谱指纹图谱研究的技术要求(暂行)》的通知[J].中成药,2000(22):671-673.
[8]吕连媛,张黎明,王艳乔,等.银杏萜内酯A、B、C和白果内酯的热特征分析[J].天津科技大学学报,2011,26(5):9-12.
(编校:王冬梅)
《中国生化药物杂志》参考文献标准
综述类文章参考文献一般不少于25条,其他论文一般不少于15条;采用顺序编码制著录,依照其在文中出现的先后顺序用阿拉伯数字加方括号标出;参考文献请作者尽量选择近3年发表的文献。参考文献需引用本刊1~2篇文献;参考文献的作者,1~3名全部列出,3名以上者只列前3名,后加“等”或“et al”。英文文献中的作者姓名写法为:完整姓氏在前,名字采用缩写字母在后。外文期刊缩写以美国国立医学图书馆编辑的《Index Medicus》格式为准;中文期刊用全名。
举例:
期刊:[序号]作者.文题[J].刊名,年,卷(期):起页-止页.
书籍:[序号]作者.书名[M].版次.出版地:出版者,出版年:起页-止页.
Simultaneous determination of four lactones ingredients content in Shuxuening injection by quantitative analysis of multi-components by single marker
MU Xiao-yin1Δ, LIU Li2
(1.Department of Science and Technology, Guizhou Pharmaceutical (Group) Limited Liability Company, Guiyang 550000, China; 2.Department of Pharmacy, The Third People’s Hospital of Guizhou, Giyang 550000, China)
ObjectiveTo simultaneous determine four lactones(bilobalide and ginkgolides A, B and C) ingredients content in Shuxuening injection by quantitative analysis of multi-components by single marker (QAMS),and evaluation the methodological.MethodsWith Ginkgo esters as the indexes,the relative correction factor(RCFs) between bilobalide and ginkgolides A, B, C were established. The content of bilobalide in Shuxuening injection were determined by external standard method, the content of ginkgolides A, B, C in Shuxuening injection was calculated by the relative correction factor. The results of the content of 5 batches of Shuxuening injection determined by QAMS and tested by external standard method were carried out by t test. ResultsThe RCFs of ginkgolides A, B, C with reference to bilobalide were 2.280,1.659 and 1.429.And the repeatability was good under different experimental conditions. There was no significant differences between the calculated value and estimated value on QAMS and external standard method of the 5 batches of Shuxuening injection, the results showed that the RCF was authentic.ConclusionThe established correction factor is good repeatability,and could be used for quantitative analysis and quality evaluation of multiple components in Shuxuening injection.
multi-components by single marker(QAMS); Shuxuening injection; relative correction factor(RCFs); total lactones; indexes; external standard method
穆箫吟,通信作者,女,本科,主管药师,研究方向:药物质量分析,E-mail:2484014252@qq.com。
R284.1
A
1005-1678(2016)01-0169-05