柱前衍生化RP-HPLC法测定L-叔亮氨酸含量

陈亭亭，黄　金，陈蔚青，王　普

(1.浙江工业大学 药学院, 浙江 杭州 310014；2. 浙江树人大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310015)

柱前衍生化RP-HPLC法测定L-叔亮氨酸含量

陈亭亭1，黄金1，陈蔚青2，王普1

(1.浙江工业大学 药学院, 浙江 杭州 310014；2. 浙江树人大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310015)

摘要：以2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯(GITC)为手性衍生化试剂，建立一种反相高效液相色谱测定L-叔亮氨酸的方法.以GITC为衍生化试剂对L-叔亮氨酸进行衍生化，优化衍生化试剂用量和衍生化时间等反应条件.使用岛津C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)分离衍生化产物，流动相为V(甲醇)∶V(磷酸盐)=58∶42的缓冲溶液(pH=2.8)，流速为0.6 mL/min，检测波长为254 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL，结果表明叔亮氨酸两个对映异构体的衍生化产物分离良好，在0.2～1.0 mmol/L范围内呈现良好的线性关系(r=0.999 6).该方法准确可靠，重现性好，适用于L-叔亮氨酸的含量测定.

关键词：柱前衍生化；反相高效液相色谱法；L-叔亮氨酸

非天然氨基酸在药物合成中具有广泛的应用，如用于抗生素、抗癌、抗病毒以及免疫抑制活性物质的合成[1].L-叔亮氨酸为非天然氨基酸，是一种重要的药学活性原料的手性砌块，可用于抗癌、抗艾滋病等药物和生物抑制剂及肽等的制备[2-3]；因其结构中叔丁基的空间位阻较大，疏水性强，结构稳定，L-叔亮氨酸及其衍生物常作为催化剂和金属性配体用于不对称合成反应[4].

氨基酸分析方法归纳起来主要有直接分析法和衍生化间接分析法两类：直接分析法是指高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培法(HPAEC-IPAD)；衍生化间接分析法是将氨基酸衍生化为利于测定或分离的化合物.由于采用常规的紫外检测器不能直接检测不含生色基团的氨基酸，故需将氨基酸分子衍生化为具有较强紫外或荧光吸收的衍生物后再用于检测[5].柱前衍生化高效液相色谱法进行氨基酸的分析具有时间短、灵敏度高等优点[6].利用高光学纯度的手性衍生化试剂与手性氨基酸对映异构体反应形成非对映异构体对，从而在C18柱上实现分离，可节省因使用昂贵的手性柱所增加的分析成本.2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯(GITC)是一种较好的手性衍生化试剂[7-8]，具有衍生化反应条件温和，衍生化产物较稳定等优点，并且已有利用该衍生化试剂分析某些氨基酸，胺类药物对映异构体的报道[9-11].

目前有关L-Tle的测定方法报道较少.Li Jing等[12]采用冠醚手性柱CROWN-PACK(+)，以高氯酸水溶液为流动相，采用HPLC法对L-Tle进行分析，但柱温要求维持在4 ℃，并不适于常规分析；Liu Weiming等[2]采用配基交换手性柱CHIRALPAK MA(+)，通过HPLC法测定L-Tle，以2 mmol/L的CuSO4为流动相，该手性柱利用手性配基和二价金属离子形成螯合物,以适当的浓度分布于流动相中，利用手性配体与对映体的选择性，与金属离子共同形成消旋异构体的配合物，然后利用正相或反相色谱柱进行拆分[13].由于手性柱相比于C18柱较为昂贵，且上述两种手性柱对有机溶剂非常敏感，使用不当会溶解手性固定相，对柱子造成不可逆的损坏.Seo[3]，Ju-Yean Kim[14]和Eun young Hong[15]等采用C18柱，以GITC为衍生化试剂的柱前衍生化HPLC法测定L-Tle的e.e.值，但文献中均无对其

衍生化条件的详细报道.笔者对L-叔亮氨酸与GITC衍生化反应的衍生化温度，时间，衍生化试剂用量等条件进行优化，考察了衍生化产物的HPLC分析方法学，并采用C18柱对DL-叔亮氨酸对映异构体实现了较好的分离.

1实验部分

1.1仪器、试剂与材料

岛津SPD-10A液相色谱仪；InterSustain C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯(纯度大于98%，购自上海笛柏化学品技术有限公司)；L-叔亮氨酸(纯度99%，购自阿拉丁)，DL-叔亮氨酸(纯度98%，购自安耐吉化学)；甲醇，乙腈(均为色谱纯，杭州普修科技生物有限公司)，磷酸二氢钾(分析纯，湖州湖试化学试剂有限公司)，三乙胺(分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司)，磷酸(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司).

1.2色谱条件

C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，检测波长254 nm；进样量10 μL.流动相：V(甲醇)∶V(磷酸盐)=58∶42的缓冲液；柱温：30℃；流速：0.6 mL/min.

基于表3的排序结果，可以针对特定的大学生，分析影响其综合素质的因素，特别是涉及关键控制点的值，并剖析其产生的客观原因或主观原因，进而加以改进。

1.3储备液配制

A液：V(乙腈)∶V(水)=1∶1的溶液；B液：称取3.94 mg L-叔亮氨酸(或DL-叔亮氨酸)于10 mL容量瓶，用A液定容，配制成3 mmol/L L-叔亮氨酸(或DL-叔亮氨酸)溶液；C液：移取42 μL TEA于10 mL容量瓶，用A液定容；D液：称取23.4 mg GITC于5 mL容量瓶，用A液定容，配制成12 mmol/L的GITC溶液，于4 ℃冰箱保存.

1.4衍生化方法

准确移取200 μL B液和200 μL C液于1.5 mL EP管，混合均匀，加入200 μL D液，涡旋混匀，置35 ℃水浴下反应60 min.GITC与叔亮氨酸的胺基反应，反应原理为

2结果与讨论

2.1衍生化反应条件优化

2.1.1衍生化反应时间优化

分别选取衍生化反应时间15，30，60，90，120，150 min，置于室温下反应.反应结束后，按方法1.2测定衍生化反应产物.当反应60 min时，峰面积达到最大，继续延长反应时间，峰面积不再增加，表明衍生化反应60 min已基本完成.故选择衍生化反应时间为60 min.

2.1.2衍生化反应涡旋时间优化

分别选取涡旋时间0，5，10，15，20，25，30 s，置于室温下反应60 min后，按方法1.2测定衍生化反应产物.当增加涡旋时间时，峰面积基本不变，表明涡旋时间对于衍生化的影响不大.但为保证各添加物混匀，同时节省操作时间，故涡旋时间选择5 s内.

2.1.3衍生化试剂用量优化

分别选取衍生化试剂与L-叔亮氨酸的浓度比为1∶1，1.5∶1，2∶1，2.5∶1，3∶1，4∶1，4.5∶1，5∶1，置于室温下反应60 min，按方法1.2测定衍生化反应产物.当GITC与L-Tle浓度比≥4∶1时，峰面积达到最大，同时考虑到节省衍生化试剂，故选择二者最佳浓度比为4∶1.

2.1.4衍生化反应温度优化

分别选取反应温度25，35，45，55，65，75 ℃.在GITC与L-Tle浓度比为4∶1条件下衍生化，反应60 min，按方法1.2测定衍生化反应产物.当反应温度为35 ℃时，峰面积达到最大，当温度高于45 ℃后，温度影响趋于平缓.故选择35 ℃为反应温度.

2.1.5衍生化反应三乙胺用量优化

在GITC的衍生化反应中，三乙胺作为催化剂使反应得以进行.选取三乙胺浓度为10，30，60，90 mmol/L，考察对衍生化的影响.在GITC与L-Tle浓度比为4∶1条件下衍生化，35 ℃反应60 min，反应结束后，按方法1.2测定衍生化反应产物.当三乙胺浓度≥30 mmol/L时，有副产物产生，且有较多杂峰出现.故选择三乙胺浓度为10 mmol/L.

2.2方法学考察

2.2.1线性关系考察

如图1所示，精密称取0.013 1 g L-Tle，用10 mL溶剂(V(乙腈)∶V(水)=1∶1)溶解配制成浓度为10 mmol/L的标准溶液.并稀释至0.2，0.4，0.5，0.6，0.8，1.0 mmol/L.经衍生化后，采用HPLC法测定，以衍生物峰面积(Y)对样品摩尔浓度(X)进行线性回归，得回归方程：Y=1.508 4×107X-2.030 4×106，r=0.999 6，线性范围为0.2～1.0 mmol/L.

图1　衍生化产物及GITC色谱图Fig 1　Chromatograms of the derivatives and GITC

2.2.2定量限与检测限

取L-Tle标准溶液(0.2 mmol/L)逐步稀释，当信噪比为3∶1时，L-Tle的检测限为0.02 mmol/L；当信噪比达10∶1时，定量限为0.06 mmol/L.

2.2.3精密度考察

配制0.2，1.0 mmol/L两种浓度的L-Tle溶液，经衍生化后，按照1.2HPLC条件连续测定5次，RSD分别为1.30%，0.89%.

2.2.4稳定性考察

L-Tle标准溶液(1 mmol/L)，经衍生化后室温放置0，2，4，6，8，10，12，24 h后分别HPLC测定，衍生化产物在8 h内，RSD为1.63%，10 h后RSD大于2%.表明衍生化产物在8 h内稳定.

2.2.5重复性考察

精密量取L-叔亮氨酸样品适量，共5份，经衍生化后进行HPLC测定，平均含量为0.51 mmol/L，RSD为0.66%.

2.2.6加标回收率考察

准确移取L-Tle样品溶液(10 mmol/L)0.3 mL(共9份)，分别置于10 mL容量瓶中，再加入0.3 mL，1.2 mL，2.1 mL标准溶液(10 mmol/L)各3份.经衍生化后进行HPLC测定，计算各瓶中供试品浓度，结果见表1.

表1　L-叔亮氨酸回收率

3结论

L-叔亮氨酸是多种药物合成中重要的原料或中间体，对光学活性叔亮氨酸的定量检测具有重要的实际意义.通过对其GITC衍生化条件的优化，建立了L-叔亮氨酸柱前衍生化的高效液相色谱检测方法，采用该方法可使DL-叔亮氨酸实现良好的分离，相对于手性固定相法更为经济，为非天然氨基酸的手性分离提供了重要参考.

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(责任编辑：陈石平)

Determination of L-tert-leucine by reversed-phase high performance liquid chromatography with pre-column derivatization

CHEN Tingting1, HUANG Jin1, CHEN Weiqing2, WANG Pu1

(1.College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China；2.College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang Shuren University, Hangzhou 310015, China)

Abstract:A pre-column derivatization-high performance liquid chromatographic (HPLC) method was established for the determination of L-tert-leucine (L-Tle) with 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl isothiocyanate (GITC) as a chiral derivatization reagent. L-Tle was derivatized with GITC and the conditions of derivatization such as the quantity of GITC and the derivatized time were optimized. The resulting samples were analyzed by HPLC using an InterSustain C18column (250×4.6 mm, 5 μm). The mobile phase was a 58∶42 mixture of methanol and phosphate buffer (pH=2.8). The flow rate was 0.6 mL/min, and the detection wavelength was 254 nm. The column temperature was 30 ℃ and injection volume was 10 μL. The obtained diastereomers of L-Tle were well separated, and had good linear relationship in the concentration range of 0.2～1.0 mmol/L (r=0.999 6). This method is accurate, reliable and available for the determination of L-Tle.

Keywords:pre-column derivatization; reversed-phase high performance liquid chromatography; L-tert-leucine

收稿日期：2015-12-17

基金项目：浙江省公益性技术应用研究计划项目(2014C33274)

作者简介：陈亭亭(1990—)，女，浙江温州人，硕士研究生，研究方向为生物制药，E-mail：chentingting224@163.com．通信作者：王普教授，E-mail: wangpu@zjut.edu.cn．

中图分类号：Q939.97

文献标志码：A

文章编号：1006-4303(2016)04-0431-04