杨梅素脂质体的体外释放及体内吸收实验研究

钱俊青，黄　琪，竺少敏

(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

杨梅素脂质体的体外释放及体内吸收实验研究

钱俊青，黄琪，竺少敏

(浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014)

摘要：为考察杨梅素脂质体体外释放度及体内吸收状况，采用薄膜-超声分散法制备杨梅素脂质体，以质量分数为5%的SDS为溶出介质进行杨梅素脂质体体外释放度实验，以大鼠肠灌流法进行杨梅素脂质体的体内药代动力学研究.实验表明：杨梅素脂质体体外释放遵循Higuchi模型，有缓释作用；大鼠肠灌流杨梅素吸收状况为被动吸收，与杨梅素原料药相比，杨梅素脂质体吸收速率和消除速率均显著提高，药物的半衰期减小.因此杨梅素脂质体制剂相比原料药能更好地发挥药效.

关键词：杨梅素;脂质体;体外释放;肠灌流

杨梅素存在于杨梅树叶和树皮中[1]，具有抗菌、降血糖、降血压、抗炎、防止血小板聚集、抗突变和抗氧化[2-8]等多种功效.欧洲一些国家已经将杨梅素作为保健食品上市；美国FDA也批准杨梅素应用于医药、保健食品和化妆品；欧美国家将杨梅素用作适合特殊人群消炎的添加剂[9].但由于杨梅素的稳定性差、水溶困难和味苦等缺陷，对其应用带来很大局限性，因此将杨梅素制备成适宜的剂型，提高稳定性，能够改善杨梅素的应用.脂质体是将功能成分包封于类脂质双分子层薄膜中所制成的超微型球状载体剂型[10]，可以防止成分的失活以及提高生物利用度[11].目前制备固体脂质体有多种方法[12]，其中薄膜-超声分散法制备脂质体工艺过程简单、能耗小及成本低，更易于工业化[13].现在脂质体已经被广泛应用于传统中药、抗生素、食品及化妆品[14-17]中.脂质体因其类细胞膜结构，使得脂质体口服制剂具有更好的安全性和生物相容性[18].

口服脂质体在胃肠道的释放度直接影响药物的生物利用度，一般采用药物体外释放度实验来模拟人体内胃肠道消化条件下测定药物释放速率,预测药物在体内的释放和吸收[19]，是帮助了解制剂的生物药剂学特点，筛选缓控释制剂处方的重要手段[20].因此测定药物释放度对控制药物的质量具有重要的意义.口服脂质体的主要吸收部位是小肠，肠道中的吸收也是决定药物生物利用度的重要因素[21]，药物吸收不仅依赖药物理化性质，还有很多影响因素[22].因此探讨药物在小肠内吸收机制对提高药物的生物利用度和药效具有重要意义.评价药物在肠道吸收的方法有离体法、在体法和体内法[23-24]，在众多方法中,在体法因不损害研究部位的淋巴和循环系统且方法简单而明显优于其他2种方法，他能够反映肠管内的真实生存环境，且实验技术已经成熟.ZHAO等研究发现药物在大鼠体内吸收与人体内吸收存在高度相关性，可以用大鼠代替人体进行临床前口服药物吸收的研究[25].本实验以杨梅素脂质体为对象，测定其体外释放度，研究其体外释放规律；同时采用大鼠在体肠灌流法对杨梅素原料药及杨梅素脂质体的吸收动力学进行研究，通过测量灌流前后肠腔内药物浓度的变化来考察药物的小肠吸收状况，为研制杨梅素脂质体口服制剂提供制剂学基础.

1材料与方法

1.1材料

杨梅素(质量分数为98.1%)，浙江省宁波市中药制药有限公司；大豆卵磷脂(质量分数为70%)，江苏曼氏生物科技有限公司；十二烷基硫酸钠(SDS)，国药集团化学试剂有限公司；酚红，上海试剂三厂；SD大鼠，体重(200±20) g，雄老鼠，浙江省医学科学院动物中心提供；其他试剂均为分析纯.

1.2仪器与设备

752型紫外可见光度计，上海光谱仪器有限公司；SP-2500双光束紫外分光光度计，苏州市莱顿科学仪器有限公司.

1.3杨梅素脂质体制备

精密称取20 mg杨梅素、质量分数为70%的大豆卵磷脂和载体材料于梨形烧瓶中，单硬脂酸甘油酯为载体，m(质量分数为70%的卵磷脂)∶m(载体)=1∶1，加入10 mL无水乙醇使三者充分溶解,置于旋转蒸发器中，0.085 MPa真空度65 ℃下减压回收乙醇成膜，然后加入60 mL质量分数为0.06%的吐温40水溶液，使膜溶解分散并且充分水合，800 W超声10 min，最终形成杨梅素脂质体.用激光粒径分析仪测得杨梅素脂质体平均粒径为(145.1±33.4) nm(多分散系数为0.281)，zeta电位为-36.62 mV.

2实验方法

2.1体外释放度实验

2.1.1杨梅素体外释放含量测定方法

杨梅素的结构式为

采用分光光度法测定杨梅素含量.通过杨梅素全波段扫描，确定357 nm为吸收波长，称取杨梅素无水乙醇溶解定容，配置成一系列标准溶液，在357 nm波长下检测吸光度，绘制标准曲线，得到回归方程：A=0.051C+0.005 9(R2=0.999 5)，在2～14 μg/mL范围内，线性相关性良好.

2.1.2体外释放度的测定方法

取适量的杨梅素脂质体及等剂量的杨梅素原料药，分别装于透析袋中，将透析袋两头扎紧，置于质量分数为0.5%的SDS介质溶液中(通过一系列浓度的SDS溶液的筛选，质量分数为0.5%的SDS溶液可满足体外释放及漏槽条件)，按照50 r/mim，(37±2) ℃水浴恒温，定时取样，同时加入等量的空白释放介质，则杨梅素累积释药百分率计算式为

杨梅素累积释放量：

Qn=Cn×V+∑Ci×Vs

(1)

杨梅素累积释药百分率：

P=Qn/Q0×100%

(2)

式中：Cn为第n次取样点时的杨梅素浓度；Ci第i次取样点时杨梅素浓度；V为溶出介质体积；Vs为每次的取样体积；Q0为初始杨梅素的量.

用释放模型方程对药物0～96 h的体外累计释放数据进行拟合,以此描述杨梅素脂质体制剂的体外释放规律.

2.2大鼠在体肠吸收实验

2.2.1肠循环液中杨梅素含量的测定方法

为了避免实验过程中小肠吸收和分泌的水分对药物浓度造成的影响，通过加入“标示物”来测定水分的变化进行校正[26]，同时采用双波长等吸收消除酚红对杨梅素紫外吸收的干扰[27].

取200 mg/L酚红供试液、杨梅素脂质体溶液、含酚红的杨梅素脂质体溶液以及在大鼠体内肠循环2 h的K氏营养液，于200～600 nm紫外扫描.结果表明酚红、辅料和肠循环液分别在杨梅素596，357 nm特征吸收峰处对其没有干扰.故选择357 nm为检测波长，596 nm为参比波长，△A=A357-A596为定量信息测定杨梅素的含量.以△A对杨梅素质量浓度C进行线性回归，得标准曲线△A=0.042 2C+0.173 6(R2=0.999 8)，在0.5～14 mg/L线性范围内相关性良好.

2.2.2杨梅素脂质体在空白肠循环液中的稳定性

杨梅素脂质体在空白肠循环液中的稳定性直接影响实验的准确性，需要对其稳定性进行考察.取30 mL杨梅素脂质体溶液，加入200 mg/L酚红溶液和K氏营养液，用空白肠循环液定容至60 mL，配置成供试液.37 ℃恒温水浴2 h，分别在0，1，2 h测定供试液中的杨梅素浓度.

2.2.3肠壁物理吸附的影响

肠壁绒毛可能会因为吸附杨梅素和酚红对实验结果造成影响，需要测定肠壁物理吸附影响的大小.取大鼠小肠，清洗后置于60 mL 供试液中.在37 ℃的恒温振荡仪中2 h，分别在0，1，2 h测定供试液中杨梅素及酚红浓度.

2.2.4大鼠在体肠灌流实验

取SD雄性大鼠，禁食不禁水12 h，腹腔注射戊巴比妥钠溶液，麻醉后固定在手术台板上红外灯照射保持37 ℃体温.采用全肠段回流，沿腹中线剪开腹部约4 cm，取出十二指肠上部至回肠下部肠段，两端切口后分别插管并结扎.用37 ℃生理盐水、K氏营养液依次冲洗肠道内容物后，将插管与恒流泵连接形成回路.以5 mL/min流速将供试液在回路中循环10 min再调至2.5 mL/min，分别在0，15，30，45，60，90，120 min时取1 mL和0.5 mL样各一份，同时补加1.5 mL的37 ℃的K氏营养液，取样7次.实验装置见图1所示.

图1　在体小肠吸收实验装置Fig.1　In situ intestinal absorption experimental facility

以小肠剩余药量的对数(lnX)对取样时间(t)做图得吸收曲线，从吸收曲线可得出速率常数(Ka)和相关系数(r)，吸收半衰期(t1/2)和单位时间吸收率(P)计算式为

吸收半衰期:

t1/2=0.063 9/Ka

(3)

单位时间吸收率:

P=(C0×V0-Ct×Vt)/(C0×V0×t)

(4)

式中：Ka为吸收速率常数；C0为灌注液中药物初始质量浓度；Ct为t时刻灌注液中药物质量浓度；V0为灌注液初始体积；Vt为t时刻灌注液体积.

3实验结果与讨论

3.1体外释放度实验结果

在(37±2) ℃恒温，质量分数为0.5%的SDS释放介质中加入杨梅素脂质体，相同条件进行三组实验，以杨梅素原料药为对照，得到体外累积释放曲线，如图2所示.

图2　杨梅素及杨梅素脂质体体外释放曲线Fig.2　Releasing curves of Myricetin and Myricetin liposome in vitro

由图2可知：从12 h开始杨梅素原料药和杨梅素脂质体的释放规律逐渐出现差异：杨梅原料药释放速度加快，48 h后累积释药百分率已达到100%；杨梅素脂质体累积释药百分率平稳增加，96 h后，药物释放量只达到30%.说明杨梅素制备成脂质体后药物呈缓慢持续释放.

分别按照零级动力学模型、一级动力学模型和Higuchi方程模型进行拟合，求出相关系数r、释放常数K及SD值.比较杨梅素原料与杨梅素脂质体的体外释放规律，结果如表1所示.

表1　杨梅素及杨梅素脂质体在0.5%的SDS释放介质中释放的药动学拟合

注:1) 代表零级动力学的释放常数；2) 代表Higuchi方程的Higuchi系数.

由表1可知：杨梅素原料药遵循零级动力学规律释放；杨梅素脂质体Higuchi方程模型拟合的相关系数r最大，遵循Higuchi规律释放，符合缓释制剂的释药要求.因此将杨梅素制备成杨梅素脂质体之后，减慢了药物的释放速度，延长了药物在体内的滞留时间，有利于提高药效.三组脂质体的平行实验SD值为1.9，说明实验结果稳定.

3.2杨梅素脂质体在空白肠循环液中的稳定性结果

将杨梅素脂质体溶液在37 ℃恒温水浴放置2 h，分别在0，1，2 h时测定杨梅素浓度，实验结果表明，与0 h相比，1 h后杨梅素的质量分数降低1.3%，2 h后杨梅素的质量分数降低3.8%，可能由于杨梅素自身降解导致.因此认为2 h内杨梅素脂质体在空白肠循环液中较稳定，不会干扰肠灌流实验.

3.3肠壁物理吸附的影响结果

大鼠小肠浸泡在37 ℃的60 mL供试液中，分别在0，1，2 h时测定杨梅素浓度，实验结果表明：与0 h相比，1 h后杨梅素的质量分数降低0.9%，2 h后杨梅素的质量分数降低3.0%，可能由于杨梅素自身降解导致，由此推测肠壁对杨梅素脂质体无物理吸附；与0 h相比，1 h后酚红的质量分数不变，2 h后酚红的质量分数仅微量减少0.3%，可认为无变化，故肠壁对酚红无物理吸附.综上所述，大鼠小肠壁对杨梅素和酚红均无物理吸附，不会影响二者含量的测定.

3.4大鼠在体肠灌流实验结果

通过对大鼠小肠剩余药量的测定，得到杨梅素脂质体与杨梅素原料胶束溶液在大鼠小肠2 h吸收曲线，如图3所示.

由图3可知：杨梅素脂质体的透过速率方程为lnX=7.538 4-0.003 4t，杨梅素原料的透过速率方程为lnX=7.576 7-0.000 9t，与表观一级速度方程lnX-lnX0-Kat线性吻合，因此杨梅素的吸收为被动转运，依靠生物膜两侧的药物浓度梯度被吸收，不需要载体和能量.由吸收曲线得到吸收速率常数Ka、相关系数r、吸收半衰期t1/2以及单位时间吸收率P，见表2.

图3　杨梅素脂质体与杨梅素原料体内吸收曲线(n=7)Fig.3　Absorption cure of Myricetin liposomes and myricetin in rat(n=7)

Table 2The results of Myricetin microcapsules and myricetin within micellar in intestine absorption

样品Ka吸收率P/%t1/2/min相关系数r杨梅素脂质体3.4×10-336.32040.9634杨梅素9.0×10-410.27700.9558

实验结果显示：与杨梅素原料药相比，杨梅素脂质体在小肠吸收速率常数Ka和吸收率P均显著提高，说明经脂质体化杨梅素更容易被在体吸收；计算得到的杨梅素脂质体吸收半衰期明显少于杨梅素原料药，可以预测经脂质体化的杨梅素在体内消除速率加快.

4结论

本实验以实验室制备的杨梅素脂质体为研究对象，考察其体外释放规律和体内吸收状况.实验结果表明：杨梅素脂质体遵循Higuchi规律缓慢持续释放，延长了药物在体内的滞留时间，有利于提高药效；杨梅素在体内的吸收为被动转运，与杨梅素原料药相比，脂质体化的杨梅素在体内吸收速度和消除速度均明显增大.说明经脂质体化的杨梅素更容易被吸收，有利于提高药效.本实验为今后制造口服杨梅素脂质体提供了制剂理论基础.

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(责任编辑：陈石平)

Study on release characteristic and pharmacokinetics property of Myricetin liposome

QIAN Junqing, HUANG Qi, ZHU Shaomin

(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Abstract:In order to investigate the release and absorption mechanism of Myricetin liposome, the Myricetin liposome was prepared using a dried film-ultrasonic procedure, the release characteristic of the Myricetin liposomes was then studied by the dissolution media of 5% SDS in vitro, and the pharmacokinetics property was finally evaluated by rat intestinal perfusion studies. A sustained release trend was found for Myricetin liposomes by following Higuchi law in release experiments. Myricetin liposome had a passive absorption mechanism in rat intestinal, absorption and elimination rate of Myricetin liposome were improved compared with Myricetin. And half-life of durg was obviously increased. The oral liposome formulation of Myricetin has a better efficacy as compared to Myricetin.

Keywords:Myricetin; liposome; release; intestinalperfusion

收稿日期：2015-12-22

作者简介：钱俊青(1964—)，男，浙江绍兴人，教授，博士，主要从事天然药物资源利用技术研究，E-mail：qjq@zjut.edu.cn.

中图分类号：R944

文献标志码：A

文章编号：1006-4303(2016)04-0422-05