萘普生对斑马鱼胚胎发育及运动行为的影响

徐　超，陈楚楚，章超男，王　義，金晶晶

(浙江工业大学 环境学院，浙江 杭州 310014)

萘普生对斑马鱼胚胎发育及运动行为的影响

徐超，陈楚楚，章超男，王義，金晶晶

(浙江工业大学 环境学院，浙江 杭州 310014)

摘要：非甾体抗炎药(NSAIDs)萘普生有着广泛的使用，导致其在水环境和水生生物中被广泛检出.为考察萘普生水生环境安全，以斑马鱼胚胎为模型，将其暴露于不同质量浓度的萘普生溶液中，观察各时间点的死亡率、畸形率和孵化率等，并进一步研究了萘普生对幼鱼运动行为的影响.结果表明：萘普生对斑马鱼胚胎具有致死致畸效应，呈明显的时间—质量浓度效应关系.低质量浓度组的萘普生对斑马鱼早期发育没有显著影响，而在高质量浓度下，死亡率增加显著，48 h的心包囊肿率高达85%.与发育毒性不同，低质量浓度实验组在光照和黑暗条件下均能显著刺激了斑马鱼运动，而高质量浓度2 mg/L实验组却没有明显改变其运动活力.

关键词：斑马鱼；萘普生；运动行为；毒性

非甾体抗炎药(NSAIDs)是一类不含有甾体结构的抗炎药，广泛用于骨关节炎、类风湿性关节炎等各种疼痛的缓解，是目前全球使用最多的药物之一[1]萘普生(Naproxen，NPX)作为一种广泛使用的的非甾体抗炎药(NSAIDs)，具有抗炎、退热和止疼等作用，经常在废水和生物样品中被检测到[2].已有研究表明其在市政污水厂排放口质量浓度高达5.22 μg/L，在地表水中质量浓度高达2.6 μg/L[3-4].通过目前已开展的水生毒性研究表明：长期低质量浓度的萘普生暴露对网纹水蚤的繁殖有一定的抑制作用[5].同时还能对鱼类产生潜在的甲状腺干扰效应[6].最近有研究表明：萘普生对斑马鱼关于抗氧化酶相关基因的表达有一定的影响，其在肠道内表达最为敏感[7].由此可见：萘普生对水生生物可能存在一定的毒性作用，对生态环境存在潜在威胁，所以合理评价它的危害是一项非常重要的工作.

近年来，国内外许多学者通过使用鱼类作为模式生物来研究药物的水生生物毒性，用以评价水生环境安全[8-9].斑马鱼(Danio rerio)是最常见的模型之一，这是由于其具有饲养简单，鱼卵透明易收集，遗传学背景清晰，对毒化合物敏感等优势[10].与此同时，由于其对环境的变化非常灵敏，斑马鱼行为可以作为一个评价环境风险物质的指标.例如，通过检测斑马鱼幼鱼的行为变化来比较BDE17和4'-OH-BDE17的毒性大小[11].笔者以斑马鱼为模式生物，主要研究萘普生对水生生物的毒性效应，以获得更多关于萘普生释放进入环境中的风险信息，为萘普生的水生环境安全性评价提供基础数据和科学依据.

1材料和方法

1.1仪器与试剂

主要仪器：ZebraLab行为测试系统(ViewPoint Life Science，法国)，荧光倒置显微镜，其他仪器均为实验室常规仪器.

主要试剂：萘普生(98%)购自Sigma-Aldrich公司(美国密苏里州圣路易斯).标准品首先溶解在100% DMSO中制备成储备液.临用时将储备液通过10% Hank’s 溶液(0.137 mol/L NaCl, 5.4 mmol/L KCl, 0.25 mmol/L Na2HPO4, 0.44 mmol/L KH2PO4, 1.3 mmol/L CaCl2, 1.0 mmol/L MgSO4, 4.2 mmol/L NaHCO3)逐级稀释制备成暴露液，且溶剂DMSO的体积分数为0.1%.本研究中使用的其他试剂均为色谱纯，均购于Sigma-Aldrich公司(美国密苏里州圣路易斯).萘普生的结构式为

1.2实验材料

实验生物斑马鱼(Danio rerio)购于上海斑马鱼养殖基地，并在我们实验室条件下养殖和繁殖.斑马鱼饲养在一个恒定温度(28±1) ℃，昼夜光照周期比为14︰10的水循环系统中.养殖用水需要通过活性炭过滤(pH为7.2～7.6，硬度为44～61 mg/L CaCO3).每天喂食两次丰年虫(Artemia nauplii)并及时清理缸中粪便和残余饵料，定期换水.产卵时，挑选形态正常、个体较大和健康无病的的成年健康斑马鱼亲鱼按雌雄比1︰2配对饲养于玻璃鱼缸中，用加热棒调节水温至(28±1) ℃.同时，用一层纱布将亲鱼限制在鱼缸的上半部活动，与缸底产出来的卵隔开，防止成鱼吞食鱼卵.第二天清晨天亮，安装的定时灯同时打开时，加强光照刺激，产卵开始.胚胎收集后用经活性炭过滤并曝气的洁净水洗去杂质，再加入适宜质量浓度的亚甲基蓝溶液以杀菌.将收集到的受精卵放置在(27±1) ℃恒温箱下待用.

1.3实验方法

1.3.1胚胎发育毒性实验

将收集到的斑马鱼胚胎暴露于0，0.08，0.4，2 mg/L质量浓度的萘普生溶液中，暴露至96 h.实验组均使用溶剂对照，即0.1% DMSO.质量浓度范围是根据预实验中短期暴露引起斑马鱼显著表观效应而确定的.

暴露实验以500 mL烧杯作为实验容器，每个烧杯加入400 mL 试液，随机分配100枚正常发育的胚胎.每个实验组设置3个平行.将烧杯置于温度为(28±1) ℃，光照与黑暗比为14∶10条件下培养.采用静态置换法，每24 h更换一半暴露溶液，以保证溶液浓度及溶解氧等的稳定.本毒性测试的终点包括心率、孵化率、死亡率和畸形率等.每24 h用倒置显微镜进行观察并记录，及时清除死的卵或幼鱼.

1.3.2斑马鱼幼鱼运动行为实验

斑马鱼幼鱼的运动行为实验包括暴露实验和检测实验两部分.当暴毒至120 h时，挑取之前暴露后体态正常的幼鱼用Hank’s培养液冲洗3次后转移到检测用的96孔板中，每个孔中加入100 μL Hank’s培养液，一条幼鱼.每块96孔板上包含两个质量浓度组，每个质量浓度3组平行，共2块板.幼鱼运动行为的记录通过使用ZebraLab行为记录系统来实现，所使用的软件是VideoTrack for zebrafish software version.行为实验方法参考先前的研究[12].通过设置和运行Zebrabox，评价斑马鱼幼鱼在光照和黑暗切换条件下的行为变化.在本实验中，幼鱼转移进入Zebrabox后先在光照条件下适应10 min之后，再开始行为记录.光周期刺激始于光照(10 min)，接下来是交替进行3个周期的黑暗(10 min) 和光照(10 min).总的测试时间为70 min.

1.3.3数据统计分析

实验数据处理采用Origin8.0和SPSS Statistics 19.0统计分析软件，并进行t检验和差异显著性分析，概率值P<0.05为显著，用*表示.

2结果与讨论

2.1萘普生对斑马鱼胚胎发育的影响

2.1.1萘普生对斑马鱼胚胎死亡率的影响

在斑马鱼胚胎暴露于萘普生96 h过程中，观察并记录胚胎的死亡率(死亡判断标准是心跳衰竭、体节未成形或没有尾巴)[13-14].将斑马鱼胚胎暴露于不同质量浓度萘普生在4个观察点(24，48，72，96 h)的死亡率统计于图1.图1中实验数据均以平均值

±标准偏差(SD)表示.*代表P<0.05，实验组与对照组相比，差异显著.图1结果显示，随着萘普生给药质量浓度的升高，在不同时间点胚胎死亡率都逐渐增加.并且高质量浓度组的死亡率显著高于对照组，2 mg/L实验组在4个观察点的死亡率分别为24%，27.5%，27.5%，31%.

图1　萘普生对斑马鱼胚胎24,48,72,96 h死亡率的影响Fig.1　Mortality of zebrafish embryos exposed to various concentrations of naproxen for different periods(24,48,72,96 h)

2.1.2萘普生对斑马鱼胚胎畸形率的影响

斑马鱼胚胎暴露于萘普生溶液中出现了各种不同的畸形现象，如图2所示.为了实验数据更具有统计学意义，本实验根据畸形出现的频率和强度，选取心包囊肿率及孵化率作为毒理学终点指标.

CB—身体弯曲；YSE—卵黄囊水肿；PE—心包囊水肿图2　斑马鱼胚胎及幼鱼的萘普生染毒情况Fig.2　Toxicity symptoms of naproxen zebrafish embryo and juvenile

斑马鱼胚胎暴露48 h后，心包囊肿率和孵化率如图3所示.其中斑马鱼心包囊肿率随着萘普生质量浓度的增加而增加.与正常对照组相比，萘普生0.08，0.4 mg/L组心包囊肿率无显著差异；而2 mg/L实验组的心包囊率显著上升，高达85%，如图3(a)所示.萘普生对胚胎孵化的抑制作用与质量浓度存在依赖关系，即随着萘普生质量浓度的提高，胚胎的孵化率有明显降低趋势，从对照组的100%孵化降至2 mg/L实验组的72.5% 孵化，如图3(b)所示.

斑马鱼胚胎的发育被Charles等[15]定义为7个阶段:合子(0 h)、卵裂(0.75 h)、囊胚(2.25 h)、原肠(5.25 h)、分节(10 h)、咽囊(24 h)及孵化期(48 h).分析各毒理学终点可知：实验组在染毒12 h后，部分胚胎出现卵凝结现象，这可能是由于在萘普生的影响下，胚胎由于卵膜发育得并不完善，而出现的一定量的死亡.体外和临床研究表明：NSAIDs可以富集在许多生物体内[16-17].在48 h时，由于胚胎内部有大量萘普生富集，从而影响细胞色素P450 1A酶对PAHs的调控作用[18]，从而暂缓了胚胎的发育，形成发育阻滞现象.与此同时，大量萘普生的富集还能导致胚胎及初生仔鱼的发育畸形，如心包囊肿等.其中心包囊肿为萘普生对斑马鱼胚胎最敏感的指标之一.涂文清将斑马鱼暴露于2，4，8，12 mg/L等一系列浓度的萘普生的96 h急性毒性实验中也有相似的现象[19].

图3　萘普生对斑马鱼胚胎48 h心包囊肿率及孵化率的影响Fig.3　Pericardial edema rates and hatching rates of zebrafish embryos exposed to various concentrations of naproxen after 48 h exposuring

2.2萘普生对斑马鱼运动行为的影响

斑马鱼幼鱼经不同质量浓度萘普生染毒后，在光/暗周期刺激下产生了不同周期性运动变化，如图4所示.图4中底部的白色和黑色杠分别表示光照和黑暗.实验数据均以平均值±标准偏差(SD)表示.*代表P<0.05，实验组与对照组相比，差异显著.

图4　萘普生对斑马鱼幼鱼行为活力的影响Fig.4　The effect of naproxen on zebrafish larvae behavior

由图4(a)可知：在不同质量浓度萘普生处理下，发现幼鱼的运动速度随着质量浓度的升高呈“倒U型”.其中，0.08，0.4 mg/L实验组时幼鱼平均游速分别为(2.67±0.16)，(2.52±0.08) mm/s，显著高于对照组(0.91±0.27) mm/s；而高质量浓度2 mg/L的泳速(1.01±0.05) mm/s则与对照组并无显著性差异.这可能是由于萘普生在低浓度促进斑马鱼运动，而在高浓度下抑制斑马鱼运动.这在斑马鱼胚胎暴露于氟虫腈实验中也有相类似的现象[20].

由图4(b)可知：不同质量浓度实验组斑马鱼幼鱼在光照—黑暗交替条件的运动轨迹表现出一致的模式.与对照组相比，0.08，0.4 mg/L实验组每分钟斑马鱼幼鱼的运动速度在光照和黑暗条件下均出现了不同程度的增加.与对照组相比，0.08和0.4 mg/L实验组在光照及黑暗条件均显著增加了3倍左右.而高质量浓度2 mg/L实验组斑马鱼幼鱼每分钟的游速则与其基本一致.

图4(c)显示幼鱼10 min 平均游动速度也呈现出相似的趋势.即相比对照组，0.08，0.4 mg/L暴露组幼鱼在光照及黑暗条件均显著增加了2倍左右.而2 mg/L 暴露组与对照组相比却无显著性变化.

ZebraLab斑马鱼行为轨迹记录分析系统是一套可实现自动跟踪和分析斑马鱼的运动，活动和行为的高级视频追踪系统，给研究者提供了一个可控的斑马鱼实验环境用以获取准确可靠的斑马鱼行为轨迹追踪数据[21].通过斑马鱼行为学数据可知：萘普生对斑马鱼的活动有一定的影响.相比对照组，在低质量浓度时，斑马鱼的平均游动速度有显著性的增加，活跃度明显升高；而高质量浓度组斑马鱼的平均游动速度并没有明显改变.这可能是由于萘普生能够进入斑马鱼的脑组织，促使脑神经及脊柱运动神经产生了神经毒性，从而影响运动功能.

结果表明：萘普生质量浓度在mg/L数量级上会影响斑马鱼胚胎发育及其运动功能.另一方面，萘普生持续的排入水生环境中，因而被认为是一种持久性化合物，导致非靶标水生生物持续暴露于萘普生中.因此，我们要对萘普生进行更全面的了解，同时还应加强人们正确使用药物的观念及降低废弃药物的不正确排放，以保障不会有更多的萘普生进入环境.

3结论

萘普生对斑马鱼胚胎具有致死及致畸效应.相比对照组，0.08，0.4 mg/L 实验组对斑马鱼胚胎的死亡率和畸形率都无显著性影响，而2 mg/L实验组鱼死亡率和畸形率都显著提高，其中最敏感的指标为心包囊肿.此外，萘普生对斑马鱼幼鱼的运动行为也存在一定的影响.斑马鱼幼鱼的运动速度随着萘普生质量浓度的升高呈先上升后下降的趋势，即“倒 U 型”，0.08，0.4 mg/L 实验组幼鱼的平均速度显著高于对照组，而2 mg/L实验组的泳速则与对照组无显著性差异.且与对照组相比，幼鱼对低质量浓度萘普生的反应非常剧烈，主要体现在对光暗变化时，游速瞬间增大，反应更加剧烈.但是，高质量浓度萘普生的运动规律未受明显影响.

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(责任编辑：陈石平)

Influence of naproxen on zebrafish embryonic developmental toxicity and locomotor behavior

XU Chao, CHEN Chuchu, ZHANG Chaonan, WANG Yi, JIN Jingjing

(College of Environmental, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Abstract:As one of the commonly used non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), naproxen was often detected in the sewage and aquatic organisms. In order to investigate the aquatic safety of naproxen, zebrafish embryos were used as a model, after exposing them to different concentrations of naproxen solution, the values of mortality, deformity rate and hatching rate for different toxicological end points were calculated. Furthermore the behaviors of zebrafish larvae exposed to naproxen were recorded. The results showed that naproxen had lethal effect and teratogenic effect on zebrafish embryos which showed concentration-dependent responses. Lower concentrations of naproxen had no significant influence on the early zebrafish development, but in higher concentration of 2 mg/L, the mortality of zebrafish was increased significantly, the rate of pericardial cyst at 48 h was also increased to 85% significantly. Furthermore the lower groups’ exposure caused hyper activity both in dark and light conditions, while the 2 mg/L group’s exposure did not cause alteration in locomotor behavior in zebrafish larvae.

Keywords:zebrafish; naproxen; behavior studies; toxicity

收稿日期：2015-12-25

基金项目：国家自然科学基金资助项目(21277126)；浙江省自然科学基金资助项目(Y15B070026)

作者简介：徐超(1979—)，男，浙江杭州人，副教授，主要从事环境化学及毒理学究,E-mail:chaoxu@zjut.edu.cn.

中图分类号：X506

文献标志码：A

文章编号：1006-4303(2016)04-0417-05