鱼精蛋白包覆PLA纳米囊对小鼠骨髓系树突状细胞免疫功能的影响*

杨　萍，　朱俊铭△

1武汉生物技术研究院，武汉　4300752华中科技大学生命科学与技术学院，武汉　430074

实验研究

鱼精蛋白包覆PLA纳米囊对小鼠骨髓系树突状细胞免疫功能的影响*

杨萍1，2，朱俊铭1，2△

1武汉生物技术研究院，武汉4300752华中科技大学生命科学与技术学院，武汉430074

摘要：目的探索鱼精蛋白(PS)包覆聚乳酸(PLA)纳米囊对小鼠骨髓系树突状细胞(BMDC)体外免疫应答效应的影响。方法采用复乳溶剂挥发法制备包裹模型抗原鸡卵清白蛋白(OVA)的PLA纳米囊，以PS进行表面修饰。将纳米囊作用于体外培养的BMDC，用流式细胞仪检测BMDC表面分子CD80、CD83、CD86、MHCⅠ、MHCⅡ的表达和对纳米囊的摄取情况，用ELISA法检测BMDC分泌IL-12 p70水平。结果PS包覆PLA纳米囊可显著促进BMDC表达CD80、CD83、MHCⅠ和MHCⅡ表面分子，增加BMDC分泌IL-12 p70，增强BMDC对OVA的摄取。结论PS包覆PLA纳米囊可以增强BMDC的免疫应答效果，有望成为一种良好的药物载体。

关键词：聚乳酸；鱼精蛋白；纳米囊；树突状细胞；免疫功能

疫苗是人类治疗和预防疾病最有效的手段之一。佐剂是一种能够增强疫苗抗原特异性免疫应答或改变免疫反应类型的物质。目前研究的佐剂种类繁多，但铝盐(磷酸铝、氢氧化铝)仍是使用最广泛的人注射用佐剂，主要用以增强Th2型免疫反应。铝佐剂诱导抗体生成的程度比较缓和，对多肽类疫苗的辅佐效应不太明显，并有诸多缺点，故近年来很多研究尝试采用高分子材料来制备新型佐剂以取代铝盐[1]。

聚乳酸(polylactic acid，PLA)是一种具有良好生物相容性和生物可降解性的高分子材料，可用作多肽、蛋白质、质粒DNA抗原的载体，目前受到广泛重视。PLA纳米粒包裹抗原在注射局部起到储库效应并增强吞噬细胞摄取[2]。为诱导更强的免疫反应，在高分子载体表面修饰阳离子可增强载体的佐剂效应[3]。鱼精蛋白(protamine，PS)富含精氨酸，带正电荷，已被FDA批准用于因注射肝素过量导致的或自发的出血性疾病，也可与胰岛素合用作为长效制剂。采用鱼精蛋白包覆PLA纳米囊作为疫苗载体对树突状细胞的免疫反应是一个创新的探索。

本研究以PLA纳米囊作为新型载药系统，其外包覆鱼精蛋白作为佐剂，利用其带正电荷和颗粒性，通过静电吸引与带负电的细胞相互作用，增加摄取量，增强免疫效果。

1材料与方法

1.1主要实验材料

1.1.1试剂PLA(山东济南岱罡科技有限公司)，OVA、脂多糖(LPS)、PS、聚乙烯醇(PVA)(Sigma-Aldrich公司)，重组小鼠集落刺激因子(rmGM-CSF)、小鼠白细胞介素-4(IL-4)(Peprotech公司)，RPMI-1640、胎牛血清(Gibco公司)，FITC标记抗小鼠CD80、MHCⅡ(I-A/I-E)、PE标记抗小鼠CD11c、CD83、CD86、MHCⅠ(H-2Kb)(Biolegend公司)，小鼠IL-12 p70 ELISA试剂盒(北京达科为生物技术有限公司)，BCA蛋白质测定试剂盒(江苏海门碧云天生物技术研究所)。

1.1.2仪器激光粒度仪(Zetasizer/Nano-ZS90，Malvern公司)，流式细胞仪(FC5000，Beckman公司)，探头超声仪(JY99-2D，浙江宁波新芝生物技术研究所)。

1.1.3实验动物4～8周龄C57BL/6雄性小鼠，购自武汉大学实验动物中心。

1.2OVA/PLA/PS纳米囊的制备及表征

采用复乳溶剂挥发法制备PLA纳米囊。称取50 mg PLA溶解于2 mL二氯甲烷中构成有机相。探头超声下，将0.3 mL OVA(25 mg/mL)溶液分散于有机相中，形成初乳。初乳加入含有1.5% PVA的外水相中，探头超声形成复乳。通风橱中磁力搅拌至二氯甲烷挥发完全得到固化的OVA/PLA纳米囊，用超纯水洗涤2次，除去残留PVA。在纳米囊混悬液中加入PS至终浓度5 mg/mL，搅拌2 h，用超纯水洗涤得到OVA/PLA/PS纳米囊。采用激光粒度仪对纳米囊进行粒径、Zeta电位表征，并用BCA试剂盒按说明书操作步骤进行纳米囊包封率和载药量测定。采用透射电镜观察纳米囊的形貌。

1.3小鼠骨髓干细胞的分离与培养

根据文献[4]方式分离BMDC，接种于6孔板，每孔2 mL。第3、5天换液，第7天收集培养板中半悬浮和悬浮的未成熟BMDC(imBMDC)。采用PE标记的抗小鼠CD11c对收获的细胞进行纯度检测。

1.4实验分组

实验分为正常对照组、阳性对照组、OVA组、OVA/PLA组和OVA/PLA/PS组，分别加入PBS、1 μg/mL的LPS、200 μg/mL的OVA、200 μg/mL的OVA/PLA、200 μg/mL的OVA/PLA/PS。根据实验目的分别设定细胞与药物的孵育时间。

1.5鱼精蛋白表面修饰PLA纳米囊对BMDC表型的影响

将对照组和实验组置于37℃、5%CO2条件下培养20 h。收集BMDC，PBS洗2次，以PBS重悬细胞浓度为5×106/mL，取100 μL细胞悬液置于1.5 mL EP管中，分别加入FITC标记的抗小鼠CD80、MHCⅡ，PE标记的抗小鼠CD11c、CD83、CD86、MHCⅠ及其同型对照，混匀，置4℃避光孵育30 min，PBS洗2次。流式细胞仪检测，结果以几何平均荧光强度(gMFI)表示。

1.6鱼精蛋白表面修饰PLA纳米囊对BMDC细胞因子分泌的影响

BMDC与不同处理组置于37℃、5%CO2条件下共孵育20 h后，收集各孔细胞。1 500 r/min，5 min离心收集培养上清，采用ELISA法检测IL-12 p70含量。按照试剂盒说明书进行操作，在酶标仪上读取各样品吸光度值，对应计算IL-12 p70含量。

1.7鱼精蛋白表面修饰PLA纳米囊对BMDC摄取的影响

第7天收集BMDC，用PBS洗2次，以5×105细胞/孔的密度接种于24孔细胞培养板，加入FITC-OVA溶液、FITC-OVA/PLA悬液和FITC-OVA/PLA/PS悬液至终浓度为200 μg/mL。将各组BMDC在37℃分别孵育30、60、120 min，考察孵育时间对BMDC摄取的影响。达到孵育时间，收集各孔细胞，PBS洗3次，4℃避光保存，送流式细胞仪检测。

1.8统计学方法

2结果

2.1鱼精蛋白表面修饰PLA纳米囊的表征

PLA纳米囊表面电荷为负值，而包覆鱼精蛋白后，OVA/PLA/PS的表面电荷转为正值。制得的纳米囊粒径在300 nm以内，经BCA法测得包封率为36%，见表1。从图1可知纳米囊形态规整，具有典型的核-壳结构。

Table 1Characteristics of protamine coated PLA

纳米囊粒径(nm)PDIZeta(mV)OVA/PLA220.5±2.30.015±0.005-20.4±0.6OVA/PLA/PS243.7±3.10.130±0.00319.0±0.9FITC-OVA/PLA253.6±4.40.069±0.007-13.4±1.1FITC-OVA/PLA/PS294.6±6.30.197±0.01214.8±0.8

标尺为100 nm图1　OVA/PLA纳米囊(A)和OVA/PLA/PS纳米囊(B)的透射电镜图Fig.1 Transmission electron microscopy(TEM)of OVA/PLA nanocapsule(A)and OVA/PLA/PS nanocapsule(B)

2.2鱼精蛋白表面修饰PLA纳米囊对BMDC表面分子的上调作用

流式细胞仪检测CD11c结果显示细胞纯度为85%～90%，这为后续细胞实验提供了可靠的支持。如图2所示，OVA/PLA/PS组的BMDC细胞表面分子CD80、CD83、MHCⅠ、MHCⅡ表达均显著高于OVA/PLA组。OVA/PLA/PS组与OVA/PLA组相比，CD86表达没有显著差异。

2.3鱼精蛋白包覆PLA纳米囊对BMDC细胞因子分泌的调节

经ELISA法检测结果如表2所示，OVA/PLA/PS可以显著增加细胞因子IL-12 p70的分泌。

A：正常对照组；B：阳性对照组；C：OVA组；D：OVA/PLA组；E：OVA/PLA/PS组；与正常对照组比较，*P<0.05 **P<0.01图2　纳米囊对BMDC表型的影响Fig.2 Effect of nanocapsule on the phenotypes of BMDCs

组别IL-12p70(pg/mL)正常对照组1.21±0.24阳性对照组239.56±23.36**OVA组4.77±0.89OVA/PLA组46.28±9.70*OVA/PLA/PS组175.26±14.22**

与正常对照组比较，*P<0.05**P<0.01

2.4鱼精蛋白包覆PLA纳米囊对BMDC摄取的影响

流式细胞仪检测结果如图3所示。FITC-OVA/PLA/PS和FITC-OVA/PLA都能显著增强BMDC的摄取，且FITC-OVA/PLA/PS的增强作用更显著。随着时间延长，BMDC对FITC-OVA/PLA/PS的摄取作用在2 h显著增强。

与FITC-OVA/PLA组比较，*P<0.05图3　BMDC对FITC-OVA溶液、FITC-OVA/PLA纳米囊和FITC-OVA/PLA/PS纳米囊的摄取Fig.3 Uptake of FITC-OVA solution，FITC-OVA/PLA and FITC-OVA/PLA/PS nanocapsules by BMDCs

3讨论

PLA纳米囊是广泛应用于抗原转运的载体，近年来研究热点集中于对PLA纳米囊的表面修饰及其对免疫反应类型的影响。文献报道纳米囊表面修饰正电荷物质可以增强细胞摄取，诱导更强的免疫反应。鱼精蛋白是一种带正电荷无毒且具有生物可降解性的材料[5]。本实验制备鱼精蛋白包覆PLA纳米囊，考察其细胞免疫效应，为制备新型疫苗载体提供初步的实验依据。

本实验制备的PLA纳米囊粒径为200～400 nm，介于可被BMDC有效吞噬的粒径范围[6]。PLA纳米囊包覆鱼精蛋白后Zeta电位由负变正，表明正电荷鱼精蛋白已经有效包覆于PLA纳米囊表面。树突状细胞是非常重要的抗原递呈细胞(APC)，在激发体内免疫反应的过程中起到关键性作用。在BMDC表型分析中，我们发现OVA/PLA/PS能显著上调BMDC表面分子CD80、CD83、MHCⅠ、MHCⅡ的表达。CD83表达的增加意味着树突状细胞由不成熟状态转为成熟状态[7]。而BMDC的表面分子不仅仅是BMDC分化成熟的标志，同时也是BMDC发挥其免疫功能的重要组成部分。

IL-12 p70是BMDC分泌的细胞因子，大量的研究证明成熟的BMDC分泌的IL-12 p70可促使活化后的T细胞分化为Th1细胞，在Th1细胞的分化和CTL反应中占据着重要的位置。本研究发现，OVA/PLA/PS对BMDC分泌IL-12 p70有显著上调作用，这表明鱼精蛋白包覆PLA纳米囊可能使T细胞反应向Th1和CTL反应方向发展。

树突状细胞的摄取是疫苗发挥免疫效应的前提。本研究采用流式细胞仪检测了BMDC对包裹FITC-OVA的各种纳米囊的吞噬特征，发现鱼精蛋白包覆PLA纳米囊可以显著增强BMDC的摄取。鱼精蛋白调整纳米囊表面的Zeta电位由负转正，可提高纳米囊与带负电荷的BMDC的静电吸引力，增加被BMDC吞噬的机会[8]。这种摄取在37℃下，随时间延长而增加，呈时间依赖性。BMDC在同等条件下能摄取更多的抗原可能是促进BMDC成熟、增强其免疫效果的原因。

综上所述，我们的研究表明鱼精蛋白包覆PLA纳米囊可增强BMDC的摄取，上调BMDC表达CD80、CD83、MHCⅠ、MHCⅡ，促进BMDC分泌诱导细胞免疫反应的细胞因子IL-12 p70，提示其具有诱导细胞免疫反应的作用，从而为新型疫苗的研发开辟了一条新途径。

参考文献

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(2015-05-25收稿)

Effect of Protamine Coated PLA Nanocapsule on the Immune Function of Murine BMDCsInVitro

Yang Ping1，2，Zhu Junming1，2△

1WuhanInstituteofBiotechnology，Wuhan430075，China2SchoolofLifeSciencesandTechnology，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430074，China

AbstractObjectiveTo investigate the effect of protamine(PS)coated polylactic acid(PLA)nanocapsule on the immune response of murine bone marrow-derived dendritic cells(BMDCs).MethodsPLA nanocapsules were prepared by W1/O/W2method.Protamine was used to modify the surface of PLA nanocapsule that encapsulated ovalbumin(OVA)，a model antigen.The prepared OVA/PLA/PS nanocapsules were used to stimulate BMDCs.Flow cytometry was used to analyze the expression of surface molecules CD80，CD83，CD86，MHCⅠ，and MHC Ⅱ，and the uptake of nanocapsule.The levels of IL-12 p70 secreted by BMDCs were detected by ELISA.ResultsOVA/PLA/PS nanocapsules could significantly up-regulate the expression of CD80，CD83，MHCⅠ，and MHC Ⅱ in BMDCs，and increase the secretion of IL-12 p70 by BMDCs.Furthermore，OVA/PLA/PS nanocapsules could enhance the uptake efficiency of OVA by BMDCs.ConclusionOVA/PLA/PS nanocapsule can enhance the immune response of BMDCs，and may become a good drug delivery carrier.

Key wordspolylactic acid(PLA)；protamine；nanocapsule；bone marrow-derived dendritic cell(BMDC)；immune function

中图分类号：R392.12

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.03.012

*武汉市关键技术攻关计划资助项目(No.2014061305090453)

杨萍，女，1992年生，硕士研究生，E-mail：764183950@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：jmzhu@hust.edu.cn