CTGF在肝纤维化过程中的表达变化及其对大鼠肝星状细胞功能的影响*

余　琴，　王乾华，　毕　昊，　余　谨，　付　蓉，　杨　茹

1武汉血液中心检验科，武汉　4300302华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科，武汉　430022

CTGF在肝纤维化过程中的表达变化及其对大鼠肝星状细胞功能的影响*

余琴1，王乾华2，毕昊1，余谨1，付蓉1，杨茹1

1武汉血液中心检验科，武汉4300302华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科，武汉430022

摘要：目的探讨结缔组织生长因子(CTGF)在肝纤维化过程中的表达变化，并观察其对大鼠肝星状细胞(HSC)功能的影响。方法采用ABC免疫组化法观察肝纤维化动物模型制模后不同时间点的CTGF表达变化；构建CTGF 2个不同基因位点的shRNA重组体质粒并转染HSC，利用实时PCR检测CTGF表达，通过MTT及细胞粘附实验检测细胞功能变化。结果随着肝纤维化进展，CTGF阳性表达呈增强趋势(P<0.05)；成功构建表达靶向CTGF的shRNA重组真核表达质粒；MTT实验结果显示干扰质粒组细胞增殖水平[吸光度值为(0.81±0.06)]弱于对照组(1.39±0.07)及阴性质粒组(1.28±0.06)，均P<0.05；细胞粘附实验表明干扰质粒组细胞粘附率为(38.1±6.2)%，明显低于对照组的(63.1±3.6)%和阴性质粒组的(62.2±5.0)%，均P<0.05。结论CTGF参与了肝纤维化的过程，是促进肝纤维化发展的最重要细胞因子之一，且表达水平随肝纤维化进展逐渐升高。CTGF shRNA重组体能明显抑制HSC的增殖和粘附能力。

关键词：结缔组织生长因子；肝纤维化；肝星状细胞；细胞增殖；细胞粘附

肝纤维化的发生机制较为复杂，目前认为其形成主要是由于细胞外基质的增加而不是降解的减少[1]。在肝纤维化的发病过程中，细胞因子始终是人们研究的热点。目前认为，结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)被视为转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的下游反应元件，在器官纤维化病变中可能起中心作用[2]。本文拟探讨CTGF在肝纤维化过程中的表达变化，并构建CTGF 2个不同基因位点的shRNA重组体质粒，观察其对大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)功能的影响。

1材料与方法

1.1主要材料

成年雄性Wistar大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物学部提供)、ABC免疫组化试剂盒(VECTOR)、CTGF多克隆抗体(Abcam)、HSC-T6(武汉巴菲尔生物公司)、胎牛血清(Gibco)、LipfectamineTM2000(Invitrogen)、TAKARA RNA LA PCR kit(TAKARA)、SYBR Prime Script RT-PCR Kit(TAKARA)、MTT工作液(Sigma)、DMSO(Sigma)、层粘连蛋白(武汉谷歌生物)。

1.2实验分组及建模

选取健康成年雄性Wistar大鼠32只，体重(230±20)g，适应性喂养1周后随机分成正常组、模型组(建模后1、4、8周组)，每组8只。模型组大鼠给予首剂5 mL/kg CCl4分析纯后按3 μL /g体重的剂量皮下注射40% CCl4油剂，每周2次。分别在注射CCl4后第1、4、8周分批处死动物，留取肝脏组织，立即固定于4%多聚甲醛，石蜡包埋，7 μm厚切片。

1.3免疫组织化学染色

采用免疫组化ABC法。石蜡切片常规脱蜡，加入配好的0.3%过氧化氢甲醇溶液室温孵育以消除内源性过氧化物酶，0.01 mol/L的柠檬酸缓冲液热修复抗原，正常血清封闭。加入CTGF一抗(1∶100)4℃孵育过夜，次日取出切片，再依次滴加生物素化二抗、ABC液，最后DAB显色，苏木精复染。常规乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片保存。用PBS代替一抗作为阴性对照。采用HPIAS-1000高清晰度彩色医学图像分析系统对各组单位面积中反应阳性颗粒的表达进行定量分析。每组每只动物随机抽取6张切片，每张切片随机选取5个高倍镜视野，测定每个视野反应阳性产物的平均吸光度值。

1.4构建CTGF shRNA重组质粒并转染HSC-T6

1.4.1HSC-T6细胞培养及传代使用含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞贴壁90%以上时，用胰酶消化传代，每3～4天传代1次。

1.4.2构建CTGF 2个不同基因位点的shRNA重组体质粒并鉴定在NCBI的GenBank上选取大鼠CTGF的基因序列(序列号NM_022266.2)，参考小干扰RNA(siRNA)设计原则[3]，利用在线设计软件，设计2对shRNA序列和1对阴性对照序列，使用BLAST将选定的序列和大鼠基因组进行比对，验证均为单一基因。将干扰序列以PCR的方式插入到载体pGenesil 1.2中。反应条件：94℃预变性5 min；94℃ 10 s，37℃ 10 s，72℃ 55 s，共25个循环；72℃延长3 min。PCR产物纯化后进行酶切及与载体的连接，后进行质粒的转化及提取，并用酶切及测序鉴定。

1.4.3转染HSC-T6于转染前1 d按每孔细胞密度为3×105/mL将细胞接种于6孔细胞培养板内，第2天待细胞达70%融合时进行转染，转染前将细胞培养液更换为无血清无双抗的DMEM，并将脂质体与质粒放置室温平衡温度。按LipfectamineTM2000说明书提供的优化条件及操作说明进行。转染24、48、72 h分别计算转染效率，取最佳时间点收集细胞进行检测。各组细胞随机选取10个视野，转染效率(%)=阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.5RT-PCR检测CTGF表达

从细胞样品中提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳纯化RNA并用分光光度计检测其纯度。反转录反应使用TAKARA RNA LA PCR kit(AMV)，反应液配制按试剂盒要求操作。PCR反应液用SYBR Prime Script RT-PCR Kit(Perfect for Real-time)，反应体系为25 μL。选择β-actin为内参照物。对扩增产物进行熔解曲线分析，温度从55℃以0.2℃/s升至95℃，用于评估扩增特异性，如熔解曲线为单峰，说明扩增产物特异性好。扩增结果用β-actin的浓度校正，用2-ΔΔCt法计算出目的基因mRNA表达量。

1.6MTT法检测细胞增殖能力

将HSC-T6分为3组，分别为空白对照组、阴性质粒对照组和干扰质粒组，接种于48孔板内，常规培养48 h后每孔加入5 mg/mL MTT，置于37℃培养箱中继续培养4 h后，终止培养，每孔加入DMSO溶液150 μL，充分振荡10 min，使结晶充分溶解，酶标仪检测570 nm处各孔吸光度(A)值。

1.7粘附实验检测细胞粘附能力

24孔培养板每孔加入层粘连蛋白溶液0.2 mL，37℃放置过夜，PBS液洗2次，再加入3%牛血清白蛋白0.2 mL，孵育2 h，PBS液洗2遍，包被备用。取1×105的单细胞悬液分别接种于已包被不同细胞外基质(ECM)的板内，于37℃保温后，弃去未粘附的细胞，再用PBS洗2遍，在显微镜下随机挑取10个不相关视野计数粘附细胞，计算粘附细胞百分比。

1.8统计学处理

2结果

2.1免疫组织化学检测CTGF的表达变化

在正常对照组及1、4、8周肝纤维化模型组中均能检测到CTGF的表达，且不同组的表达量不同。正常组肝组织CTGF表达呈弱阳性，明显低于模型组(均P<0.05)。而在1、4、8周模型组，随着时间的延长，CTGF阳性表达呈增强趋势，且组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。见图1和表1。

A：正常对照组；B：建模1周组；C：建模4周组；D：建模8周组图1　免疫组化法检测CTGF的表达(×200)Fig.1 Detection of CTGF expression by immunohistochemistry(×200)

分组nCTGF对照组60.0367±0.0152建模1周组60.0934±0.0381*建模4周组60.1252±0.0396*#建模8周组60.1864±0.0329*#△

与对照组比较，*P<0.05；与建模1周组比较，#P<0.05；与建模4周组比较，△P<0.05

2.2成功构建表达靶向CTGF的shRNA重组真核表达质粒

经过PCR扩增，可得到产物shRNA CTGF，大小约700 bp(图2)。700 bp是H1启动子与U6启动子和2个靶向干扰片段的大小。阳性重组质粒经HindⅢ、BamHⅠ双酶切后，可见切出大小不等2条片段，小片段约700 bp(图3)。质粒能够被酶切出2条带，说明目的基因片段已经分别插入到质粒载体H1和U6启动子后。

经酶切后，将鉴定的阳性重组质粒送到上海生工生物技术服务有限公司测序，经BLAST比对，再次验证CTGF靶向特异性的干扰序列已成功插入pGenesil1.2载体中，进一步证实重组质粒构建成功。

1：DL2000 Marker(从上往下2 000，1 000，750，500，250，100 bp)；2：PCR扩增产物，大小约700 bp图2　PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification of CTGF shRNA

1：DL2000 Marker(从上往下2 000，1 000，750，500，250，100 bp)；2：阳性重组质粒经Hind Ⅲ、BamH Ⅰ双酶切图3　重组质粒的酶切鉴定Fig.3 Restriction digestion of the recombinant plasmid

2.3各组细胞转染率

将成功构建的质粒重组体转染HSC-T6细胞，在荧光倒置显微镜下观察细胞，各组转染率见表2。结果显示48 h转染率最高，各组均可达70%以上。

Table 2 Assay of the transfection rate in each

分组24h48h72h空白对照组44.36±5.6374.39±5.0443.83±3.61阴性质粒组47.37±6.4673.54±4.6948.51±4.28干扰质粒组46.82±3.8675.16±5.2345.49±6.68

2.4转染48 h后RT-PCR检测CTGF的表达

分别收集转染48 h后各组细胞，进行实时定量PCR。结果显示：空白对照组及阴性质粒组CTGF表达均明显高于干扰质粒组，差异有统计学意义(P<0.05)。而空白对照组与阴性质粒组间表达差异无统计学意义。见表3。

2.5MTT增殖实验和粘附实验

MTT实验结果显示，干扰质粒组吸光度值为(0.81±0.06)与对照组(1.39±0.07)及阴性质粒组(1.28±0.06)比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。细胞粘附实验结果显示，干扰质粒组粘附率为(38.1±6.2)%明显低于空白对照组的(63.1±3.6)%和阴性质粒组的(62.2±5.0)%(均P<0.05)。

Table 3 The relative expression level of CTGF mRNA in

分组CTGFmRNA空白对照组1.000±0.000阴性质粒组0.988±0.013干扰质粒组0.304±0.026*

与空白对照组比较，*P<0.05

3讨论

肝脏纤维化是机体对于肝脏损伤的反应，这个过程中伴随着损伤修复和瘢痕形成，是发展为肝硬化的基础和必要阶段。细胞外基质(ECM)的大量堆积以及肝胶原构成比变化使得肝脏组织结构和功能发生改变，最终发展成肝硬化和肝衰竭[4]。

目前公认HSC是肝纤维化形成中产生ECM的主要细胞。活化后的HSC胞质内出现平滑肌肌动蛋白，增殖活性和合成ECM成分的能力明显增强，促炎性及致纤维化作用的细胞因子，如TGF-β1、CTGF等的合成及分泌增加，进一步促进肝纤维化的形成[5-6]。

研究显示，TGF-β1在肝纤维化的发生、发展过程中具有活化HSC促进胶原基因表达，促进ECM合成与沉积的作用，是肝纤维化最重要的始动因子之一。在体外和体内的肝纤维化研究中均发现TGF-β1可特异性诱导CTGF的表达，且CTGF是TGF-β1的下游高效介质，在器官纤维化病变中起中心作用[7]。CTGF因其可能是替代TGF-β1治疗纤维化疾病的靶细胞因子而成为目前的研究热点。

本研究结果显示，CTGF在肝纤维化组织中表达明显增高，主要分布在胞质，多见于HSC、汇管区和纤维化区。此外结果亦显示，CTGF呈现持续表达，并随着时间延长，肝纤维化病情加重，CTGF表达呈现明显升高趋势，提示CTGF可能在肝纤维化过程中具有重要作用，且CTGF可能是诊断和反映肝纤维化程度的良好标志物。

RNA干扰(RNAi)是作用于mRNA水平的基因沉默技术，具有高度的序列专一性，可以高效特异地使靶向基因沉默。其机制可能是细胞内双链RNA在Dicer酶的作用下，可形成21～23 bp大小的小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)，精确降解与siRNA序列相同的mRNA，抑制了该基因在细胞内的翻译和表达，从而达到转录后水平的基因沉默[8-10]。但是siRNA是瞬间转染且无法在胞内由细胞的RNA聚合酶转录得到，因此，一种短发夹状RNA(shRNA)便得到了更广泛的应用。这种发夹环结构包括siRNA的正义链和反义链，同在一条链上互补形成发卡状，它能在体内转录后折叠成类似siRNA的分子，因而可引发稳定而持久的基因沉默。本实验成功设计构建同时含有2个靶向CTGF的shRNA表达重组质粒，并转染HSC-T6，转染后细胞的增殖能力和粘附能力明显下降。这种负向作用无疑有利于阻止或减少HSC分泌ECM，从而有利于减缓肝纤维化的发生发展。

CTGF参与了肝纤维化的过程，是促进肝纤维化发展的最重要细胞因子之一，且随肝纤维化进展逐渐升高。CTGF shRNA重组体能明显抑制HSC的增殖和粘附能力，本研究将为CTGF肝脏纤维化的靶向基因治疗提供理论基础。当然，肝纤维化的过程涉及多种生物学因子，机制相当复杂，CTGF具体的作用机制仍需进一步的研究。

参考文献

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(2015-12-08收稿)

Dynamic Expression of CTGF in Rat Hepatic Fibrosis and Its Effects on Hepatic Stellate Cells

Yu Qin1，Wang Qianhua2，Bi Hao1etal

1DepartmentofClinicalLaboratory，WuhanBloodCenter，Wuhan430030，China2DepartmentofObstetricsandGynecology，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China

AbstractObjectiveTo investigate the expression of connective tissue growth factor(CTGF)in rat hepatic fibrosis and assess its effects on hepatic stellate cells(HSC-T6).MethodsThe rat models of hepatic fibrosis were established by hypodermic injection of CCl4.The expression of CTGF in the liver was detected by immunohistochemistry at different time after the model establishment.shRNA expression plasmid vectors were constructed，targeting two different gene loci of CTGF.MTT assay and adhesion assay were conducted to examine the changes of cell functions after transfection of CTGF shRNA into HSC-T6 cells.ResultsThe expression of CTGF in the liver increased with the development of hepatic fibrosis(P<0.05).Transfection of CTGF shRNA caused a significant decrease in the proliferation and adhesion of HSC-T6 cells[absorbance(A)value of proliferation：(0.81±0.06) for interference plasmid group vs.(1.39±0.07)，(1.28±0.06)for control and negative plasmid groups，respectively，P<0.05；adhesion rate：(38.1±6.2%)for interference plasmid group vs.(63.1±3.6)%，(62.2±5.0)% for control and negative plasmid groups，respectively，P<0.05].ConclusionCTGF is implicated in the development of hepatic fibrosis.CTGF shRNA recombinants can significantly suppress the proliferation and adhesion of hepatic stellate cells.

Key wordsconnective tissue growth factor；hepatic fibrosis；hepatic stellate cell；cell proliferation；cell adhesion

中图分类号：R575.2

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.03.009

*国家自然科学基金资助项目(No.81402640)；湖北省自然科学基金资助项目(No.2014CFB406)；武汉市卫生计生委科研项目(No.WX15B23)；武汉市中青年医学骨干人才培养工程[武卫生计生(2014)77号]

余琴，女，1983年生，医学博士，E-mail：yuqin198312@163.com