白藜芦醇对大鼠急性肺栓塞后心肌细胞MCP-1及脑钠素表达的影响

吴文娜，　陈晓红

湖北省妇幼保健院成人内科，武汉　430071

白藜芦醇对大鼠急性肺栓塞后心肌细胞MCP-1及脑钠素表达的影响

吴文娜，陈晓红△

湖北省妇幼保健院成人内科，武汉430071

摘要：目的研究大鼠急性肺栓塞后心肌细胞单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)及脑钠素(brain natriuretic peptide，BNP)表达水平的变化，及中药单体白藜芦醇对其的影响。方法96只SD大鼠按完全随机设计分为血栓栓塞组(T组)，白藜芦醇+栓塞组(TR组)，各组分设1、4、8 h等3个时间点亚组，每组16只。制备大鼠自体血凝栓(将导管经右颈静脉插至肺动脉后回输自体血栓)，复制急性肺血栓栓塞模型。模型制备后，立即予尾静脉注射白藜芦醇溶液10 mg/kg(白藜芦醇溶于1%的DMSO溶液)。模型制备后1、4、8 h分别处死大鼠，取大鼠心脏用10%多聚甲醛液固定，石蜡包埋切片，以免疫组化SP法分别检测大鼠右心室心肌MCP-1、BNP表达水平。结果T、TR组各时间点大鼠心肌细胞均表达MCP-1、BNP，且随时间延长而表达增加；两组大鼠右心室心肌细胞MCP-1及BNP表达比较，术后1 h差异无统计学意义(均P>0.05)，4 h、8 h差异有统计学意义(均P<0.05)，TR组均低于T组。结论两组大鼠心肌MCP-1、BNP表达均有随时间延长而增加的趋势，中药单体白藜芦醇可能通过抑制肺栓塞大鼠心肌组织MCP-1的表达而起到保护心脏组织的作用。

关键词：肺栓塞；白藜芦醇；心肌损伤；单核细胞趋化蛋白-1；脑钠素

肺栓塞(pulmonary embolism，PE)可引起广泛的多系统功能损害，病死率极高，现已跃居心血管系统病发病率第3位[1]。近年来，有研究显示肺血栓栓塞(pulmonary thromboembolism，PTE)形成后受累的肺动脉壁中均有单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)表达[2]。本研究通过检测大鼠急性肺栓塞后MCP-1及脑钠素(brain natriuretic peptide,BNP)在心肌细胞中的表达，及中药单体白藜芦醇对其的影响，探讨白藜芦醇保护心肌细胞的可能机制，为白藜芦醇的临床应用提供依据。

1材料与方法

1.1实验动物分组

清洁级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠96只，体重300～350 g，购于中科院上海实验动物中心，随机分为血栓栓塞组(T组)，白藜芦醇+栓塞组(TR组)，各组设1、4、8 h等3个时间点亚组，每组16只。

1.2大鼠自体血栓的制备

大鼠用5%水合氯醛(3 mg/kg)腹腔注射麻醉后仰卧位固定，颈部剪毛、消毒，19G头皮针(内径1.1 mm)鼠左颈动脉取血5 mL。静置10 min，待血凝后37℃水浴20 min，用10 mL注射器将血栓推入无菌生理盐水中并切成1.1 mm×3.0 mm栓子，无菌生理盐水洗3遍，置入无菌注射器内，加生理盐水2 mL，以上操作均在无菌条件下完成。

1.3PTE模型的制备及给药

大鼠用5%水合氯醛(3 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定，颈部剪毛、消毒，颈正中切3 cm纵行切口，分离颈外静脉，插入19G聚乙烯导管，将制备好的大鼠自体血栓栓子约50个(导管接BL-420E+生物机能数据记录分析仪监测肺动脉压力在40～60 mmHg之间并控制速度，不致大鼠死亡)辅以生理盐水0.8 mL注入(0.2 mL/min)，血栓即随血液循环嵌顿于肺动脉内，按设计的时间点分别处死大鼠取出肺组织，可见栓子栓塞在肺动脉内，证明急性肺动脉血栓栓塞大鼠模型复制成功。TR组大鼠在输入血栓复制急性肺栓塞模型后，立即予尾静脉注射白藜芦醇10 mg/kg(白藜芦醇溶于1%的DMSO，白藜芦醇注射剂量依据相关文献[3])，以上操作均在无菌条件下完成，分别于制模后1、4、8 h处死SD大鼠。

1.4SP法检测MCP-1、BNP的表达

采用Medlab-u/4cs生物信号采集处理系统，压力换能器YP100型测各组大鼠肺动脉压后，取大鼠心脏并予处死。大鼠心脏用10%多聚甲醛液固定，石蜡包埋切片5 μm厚，免疫组化SP法分别检测右心室MCP-1、BNP的表达，操作按试剂盒说明。主要实验试剂包括：山羊抗兔HRP抗体，购于北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗鼠cTnI抗体、兔抗鼠MCP-1抗体购于武汉中美科技有限公司；其它为国产化学纯试剂。染色结果采用专业图像分析软件Image-Pro Plus 6.0进行半定量分析，随机选取每张切片右心室的5个视野，测定其阳性染色(棕黄色)的积分吸光度值。

1.5统计学分析

2结果

2.1光镜下观察

术后各时间点两组大鼠心肌细胞均表达MCP-1及BNP。T组、TR组炎症区心肌细胞着黄棕色，呈现不均匀细颗粒状，凝集的胞质着色稍浓，见图1、2。

图1　免疫组化SP法检测T组、TR组大鼠右心室心肌MCP-1表达(×400)Fig.1 Immunohistochemical analysis (SP method) of the MCP-1 expression in the right ventricular tissues in group T and TR (×400)

图2　免疫组化SP法检测T组、TR组大鼠右心室心肌BNP表达(×400)Fig.2 Immunohistochemical analysis (SP method) of the BNP expression in the right ventricular tissues in group T and TR (×400)

2.2指标检测

对T组、TR组免疫组化染色结果进行图像分析，检测其积分吸光度值，结果如表1、2所示。两组大鼠右心室心肌细胞MCP-1及BNP表达比较，术后1 h差异无统计学意义(P>0.05)，4、8 h差异有统计学意义(P<0.05)，TR组均低于T组。且随时间延长，MCP-1及BNP表达增加。

表1　T组、TR组各时间点大鼠右心室心肌组织MCP-1表达比较

与T组比较，*P<0.05；与1 h比较，#P<0.05；与4 h比较，△P<0.05

表2　T组、TR组各时间点大鼠右心室心肌组织BNP表达比较

与T组比较，*P<0.05，与1 h比较，#P<0.05；与4 h比较，△P<0.05

3讨论

肺栓塞(pulmonary embolism，PE)在发达国家是常见的致死性急症，未经治疗病死率高达25%～30%，而合理、及时的救治能使病死率降至2%～8%[4]。单纯血管机械阻塞机制难以解释PTE患者全部病理生理过程。近年研究表明，炎症与静脉血栓形成关系密切[5]，Kroegel等[6]发现血浆MCP-1水平与慢性血栓栓塞性肺动脉高压患者外周血管阻力呈正相关，且MCP-1主要由血管内皮细胞、平滑肌细胞和趋化至血管壁的巨噬细胞表达。但MCP-1在急性肺栓塞后引起心肌组织损伤中的作用未见相应文献报道。本文主要分析MCP-1、BNP在急性肺栓塞后的表达，以及白藜芦醇对其早期干预性治疗的效果及机制。

本实验采用大鼠自体血栓经右心房回输的方法建立急性肺栓塞模型，这也是近年来肺栓塞动物模型常用的造模方法之一。急性肺栓塞模型大鼠经解剖取出肺组织后仍可见大量栓子栓塞在大鼠肺动脉内，证明复制的急性大鼠自体血栓肺栓塞模型是成功可行的。

MCP-1属C-C趋化因子，具有趋化激活单核/巨噬细胞、T淋巴细胞的作用，在机体损伤、炎症修复方面起重要作用，同时也参与肺血管重建。本研究大鼠心肌组织行石蜡包埋切片，采用免疫组化SP法检测MCP-1表达，光镜下可见肺栓塞组大鼠心肌组织内有明显MCP-1表达，表明在肺栓塞后存在心肌损伤，术后4 h、8 h时大鼠心肌组织MCP-1表达比1 h时明显增多，并随时间的延长MCP-1表达增加，这和以往的研究相一致，表明MCP-1在急性肺栓塞后心肌损伤的病理生理过程中扮演着重要的角色。

脑钠肽(brain natriuretic peptides，BNP)主要存在于心室肌细胞内，血中BNP浓度受室壁张力影响，当室壁张力增加时，BNP从细胞释放入血的量增加，而且与心室壁张力增加程度呈正相关。本研究在光镜下可见肺栓塞组大鼠心肌组织内有明显BNP表达，且术后4 h、8 h时大鼠心肌组织BNP表达比1 h时明显增多，并随时间的延长BNP表达增加(P<0.05)，表明在肺栓塞后心室壁张力增加。在急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)动物模型中发现，单纯心肌缺血就可以刺激BNP的合成和释放[7]。近年来BNP在急性肺栓塞诊断中的应用成为热点之一。Klok等[8]在研究急性肺栓塞时发现，发生不良心血管事件的患者，其BNP浓度高于无心血管事件的患者，提示根据急性肺栓塞患者血浆BNP浓度水平能够判断预后，估计短期死亡率。根据欧洲肺栓塞诊疗指南，检测肺栓塞患者血浆BNP有助于在入院早期阶段准确预测PTE患者的不良预后，有利于指导进一步的治疗策略[9]。

中药单体白藜芦醇(Resveratrol，Res)属芪类化合物，其药理作用主要包括：抗癌作用[10]；心血管保护作用；抗氧化、抗自由基作用。最近，其抗炎作用开始受到关注[11-12]。Cullen等[13]在对培养的人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)的研究中发现，白藜芦醇可以显著抑制HUVEC中MCP-1的合成和分泌。本研究探讨白藜芦醇对急性肺栓塞后大鼠心肌组织炎症的干预作用及其机制，以挖掘白藜芦醇在心脏保护方面的药理作用。本研究免疫组化检测结果表明白藜芦醇具有抑制肺栓塞心肌组织MCP-1、BNP表达的作用，因而我们推测，白藜芦醇对急性肺栓塞大鼠的心肌组织炎症损伤的干预作用可能是通过抑制MCP-1表达，进而抑制炎症细胞聚集，起到肺栓塞后减少心肌细胞损伤，保护心肌细胞，缓解心功能不全的作用。

参考文献

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(2015-10-12收稿)

Effect of Resveratrol on the Expression of MCP-1 and BNP in Myocardial Cells of Rats with Acute Pulmonary Embolism

Wu Wenna，Chen Xiaohong△

DepartmentofInternalMedicine，HubeiMaternalandChildHealthHospital，Wuhan430071,China

AbstractObjectiveTo examine the effect of resveratrol on the expression of monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1)and brain natriuretic peptide(BNP)in myocardial cells of rats with acute pulmonary embolism.MethodsNinety-six SD rats were randomly divided into 2 groups：thromboembolism group(group T)and resveratrol + thromboembolism group(group TR)，each group having 3 subgroups(n=16 each)in terms of different time points(1 h，4 h，8 h).The model of acute pulmonary embolism was established by infusion of autologous thrombi via the catheter inserted from the right jugular vein to the pulmonary artery.In group TR，resveratrol at 10 mg/kg(dissolved in 1%DMSO solution)was injected to the rats via the tail vein.Animals were sacrificed at 1，4 and 8 h after the model establishment.The rat hearts were harvested，fixed in 10% paraformaldehyde and paraffin-embedded.The expression levels of MCP-1 and BNP were detected by immunohistochemistry(SP method).ResultsBoth MCP-1 and BNP were expressed in myocardial cells in group T and TR and gradually increased with time.The expression levels of MCP-1 and BNP were much lower in group TR than in group T at 4 and 8 h，with difference being statistically significant(P<0.05).ConclusionThe expression of MCP-1 and BNP tended to increase with time in both groups.Resveratrol may protect the heart tissues by suppressing the expression of MCP-1 in myocardial tissues of rats with acute pulmonary embolism.

Key wordspulmonary embolism；resveratrol；myocardial damage；monocyte chemoattractant protein-1；brain natriuretic peptide

中图分类号：R285.5

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.03.015

吴文娜，女，1979年生，主治医师，E-mail：prinkna@163.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：715063613@qq.com