葛根素对卡那霉素耳中毒小鼠耳蜗核因子-κB p50活性的影响

宝东艳　胡真真　李　芳　罗　启　崔　红　张　琳

(锦州医科大学基础医学院，辽宁　锦州　121001)

葛根素对卡那霉素耳中毒小鼠耳蜗核因子-κB p50活性的影响

宝东艳胡真真李芳罗启崔红张琳

(锦州医科大学基础医学院，辽宁锦州121001)

〔摘要〕目的观察葛根素对卡那霉素(KM)耳中毒小鼠耳蜗核因子(NF)-κB p50活性的影响，探讨葛根素对KM耳毒性发挥防护作用的机制。方法BALB/c小鼠随机分成四组：正常对照组，KM组，KM+葛根素组，葛根素组，各组小鼠于用药前及停药后分别测试听脑干反应(ABR)以进行正常BALB/c小鼠的筛选及听力损伤后听阈的测定。停药后测试完ABR通过Western印迹检测各组NF-κB p50的表达水平。结果KM组连续用药14 d后，不同频率的ABR阈值和NF-κB p50的表达水平明显提高，而且与正常对照组比较差异显著(P<0.01)；KM+葛根素组虽然用药后不同频率的ABR阈值和NF-κB p50的表达水平也比正常对照组高，但较KM组明显降低；正常对照组和葛根素组在整个用药期间不同频率的ABR阈值和NF-κB p50的表达水平无统计学意义(P>0.05)。结论NF-κB p50参与了KM的耳毒性，葛根素通过下调NF-κB p50进而拮抗了KM的耳毒性。

〔关键词〕葛根素；卡那霉素；耳蜗；核因子(NF)-κB

卡那霉素(KM)有很强的耳毒性，所以目前KM的应用受到一定的限制，用药物有效拮抗KM的耳毒性越来越为人们所重视。葛根素为葛根中提取的一种异黄酮类化合物。已有报道通过体外培养的方法发现，葛根素对KM培养后的小鼠毛细胞的损伤有明显拮抗效应〔1〕。也有报道称，葛根素注射液对庆大霉素所致的大鼠耳蜗毒性有防护作用〔2〕。葛根素对在体小鼠应用KM产生的耳毒性中的作用与核因子(NF)-κB的关系还鲜见报道。本实验通过制备KM耳中毒模型，结合听脑干反应观察葛根素对KM耳中毒的拮抗作用，同时应用蛋白质印迹技术探讨葛根素发挥作用是否与NF-κB有关。

1材料与方法

1.1实验动物BALB/c小鼠40只，雄性，4周龄，体重25～30 g，耳廓反应灵敏，由大连医科大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(辽)2004-0029。

1.2主要试剂和仪器硫酸卡那霉素粉剂购自美国Ameresco公司。该粉剂用生理盐水溶解，根据动物数量和体重每日新鲜配制使用。葛根素注射液购自康普药业股份有限公司，批号H20043980。兔抗NF-κB p50多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，β-actin购自博士德生物工程有限公司。Smart EP&OAE听觉诱发电位-耳声发射记录系统购自美国智听公司。

1.3方法

1.3.1实验分组及小鼠耳毒模型的制备BALB/c小鼠随机分成四组：KM组：皮下注射新鲜配制KM 750 mg/kg，2次/d；KM+葛根素组：皮下注射KM 750 mg/kg，2次/d，同时每日腹腔注射葛根素200 mg/kg；葛根素组：每日腹腔注射葛根素200 mg/kg；正常对照组：每日腹腔注射等量生理盐水。各组动物均连续注射2 w，用药期间每天监测体重以调整药量。

1.3.2ABR测试各组小鼠于用药前及停药后分别测试ABR。小鼠用1%戊巴比妥钠100 mg/kg经腹腔麻醉后，将电极的正极置于小鼠颅顶正中皮下，负极置于给声侧耳廓后下，接地电极置于对侧耳廓后下，操作在隔音屏蔽室内进行并注意动物保温。应用Smart EP&OAE听觉诱发电位一耳声发射记录系统给予短纯音刺激，选取8 kHz、12 kHz、24 kHz 3个频率分别进行测试并记录ABR阈值(听阈)，重复率39.1次/秒，带通滤波100～3 000 Hz，叠加1 024次，扫描时程16.0 ms。声刺激强度从95 dB开始，以5 dB逐次递减，听阈判定以刚出现ABRⅠ波为准并至少重复2次。测试在隔音屏蔽室内进行。用药前及停药后分别测试ABR以进行正常BALB/c小鼠的筛选及听力损伤后听阈的测定。

1.3.3Western印迹停药后测试完ABR后，立即断头处死，速取听泡，充分暴露耳蜗后，取小鼠耳蜗组织，置于液氮中，冷冻后放入-80℃冰箱备用。每组取3只小鼠的耳蜗，剪碎，PBS洗3遍，每份加入含PMSF 1 mmol/L的RIPA裂解液后匀浆，以上步骤在冰上操作。将匀浆液倒入离心管中，4℃，离心5 min后取上清，加入5倍上样缓冲液后，离心，涡旋，95℃变性5 min。将处理好的样品用SDS聚丙烯凝胶电泳分离，电转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉封闭1h，分别加入NF-κB p50 (1∶300)，β-actin一抗，4℃孵育过夜，分别加入二抗，室温摇床上孵育90 min，ECL法发光显影。显影的结果经GE Image Quent 350 电泳凝胶成像分析系统扫描后，用Image进行光密度分析，密度分析结果经内参蛋白矫正。

1.4统计学方法应用SPSS17.0软件进行单因素方差分析。

2结果

2.1ABR测试KM组连续用药14 d后，不同频率的ABR阈值明显提高，而且与正常对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)；KM+葛根素组虽然用药后不同频率的ABR阈值也比正常对照组高，但较KM组明显降低；正常对照组和葛根素组在整个用药期间不同频率的ABR阈值无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2Western印迹NF-κB p50蛋白的表达图1可见，KM组(1.43±0.14)与正常对照组(0.84±0.11)比较，NF-κB p50的表达水平明显升高。KM+葛根素组(0.97±0.15)与正常对照组比较NF-κB p50的表达水平升高，但较KM组低。葛根素组(0.81±0.13)和正常对照组差异不显著。

表1　不同频率的脑干听觉阈值

与给药前比较：1)P<0.01；与KM组比较：2)P<0.01

1：正常对照组；2：KM组；3：KM+葛根素组；4：葛根素组图1　NF-κB p50蛋白在各组的表达

3讨论

KM等氨基甙类抗生素(AmAn)耳中毒后可引起耳蜗结构的破坏，具有损害内耳的副作用，目前对这类抗生素所引起的耳聋尚无较好的防治办法。

NF-κB的活化调节着凋亡及对炎性刺激和氧化应激的反应。NF-κB的过度表达可能导致变态反应性疾病，血管疾病，缺血再灌注性神经损伤等。在内耳中，NF-κB的作用还没有完全清楚，因为NF-κB的活化可能对细胞有保护作用或者毒性作用〔3〕。一方面，Jiang等〔4〕报道NF-κB的活化对KM诱导的听力损伤有保护作用。2004年就有人提出内耳毛细胞发挥正常功能需要NF-κB〔5〕。另一方面，耳毒性刺激，例如噪声或耳毒性药物都能诱导NF-κB的活化，导致耳蜗侧壁产生很多ROS，从而造成听力损伤〔6，7〕。NO活化NF-κB，Caspase-1，进而产生ROS，造成听力损伤；茶多酚的主要成分(EGCG)则通过抑制NF-κB和Caspase，保护了听力〔8〕。顺铂诱导促炎因子的产生，通过上调NF-κB的活性产生耳毒性〔9〕。顺铂能活化NF-κB，进而介导了顺铂诱导的听觉细胞的凋亡，而同时应用NF-κB抑制剂后减弱了顺铂诱导的凋亡〔10〕。由上可知，NF-κB在听力中的作用还有争议。本实验通过检测听功能及NF-κB p50水平发现，听功能下降的同时NF-κB p50的表达增多，提示NF-κB p50 表达增多能损伤听力，与Kim等〔8〕的报道一致。

本实验室的前期工作表明〔11，12〕，正常豚鼠耳蜗多种细胞的胞质中存在NF-κB p65和p50，注射庆大霉素后，NF-κB被诱导激活，进而造成听力损害，丹参通过显著抑制KM所致NF-κB的高活性，从而有效拮抗KM的耳毒性。本实验中发现KM造成了听力损伤，可能通过活化NF-κB p50进而损伤了听力。

葛根素为葛根中提取的一种异黄酮类化合物，对突发性耳聋有明显的疗效，能有效地扩张血管，促进内耳的微循环〔13〕。通过体外培养的方法发现，葛根素对KM培养后的小鼠毛细胞的损伤有明显拮抗效应〔1〕。另外葛根素注射液对庆大霉素所致的大鼠耳蜗毒性有防护作用〔2〕。刘卫红等〔14〕研究发现经耳后注射葛根素注射液联合声频共振对早期老年性聋有较好治疗作用，并能延缓老年性聋，对耳鸣也有很好疗效。本实验证明了葛根素对KM耳毒性的拮抗作用。

本实验推测应用KM后，NF-κB p50活化，进而产生了ROS，诱导了毛细胞的凋亡，听功能下降，而葛根素通过抑制NF-κB p50，抑制了毛细胞的凋亡，进而保护了毛细胞，听功能较KM组有所改善。葛根素对KM耳毒性的拮抗作用可能有很多因子参与其中，NF-κB p50 只是其中一个，葛根素发挥作用的具体机制需要进一步探讨。

4参考文献

1董杨，王静，施建蓉.葛根素对庆大霉素所致小鼠耳蜗毛细胞损伤的拮抗效应〔J〕.中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志，2008；16(6)：401-3.

2赵慕兰，姜学钧.葛根素注射液拮抗庆大霉素耳蜗毒性的实验研究〔J〕.医药导报，2009；28(4)：452-3.

3Yamamoto H，Omelchenko I，Shi X，etal.The influence of NF-κB signal transduction pathways on the murine inner ear by acoustic overstimulation〔J〕.J Neurosci Res，2009；87(8)：1832-40.

4Jiang H，Sha SH，Schacht J.NF-κB pathway protects cochlear hair cells from aminoglycoside-induced ototoxicity〔J〕.J Neurosci Res，2005；79(5)：644-51.

5Shishodia SBB Aggarwal.Nuclear factor-κB：a friend or a foe in cancer〔J〕.Biochem Pharmacol，2004；68(6)：1071-80.

6Watanabe KI，Inai S，Jinnouchi K，etal.Nuclear-factor kappa B (NF-κB)-inducible nitric oxide synthase (iNOS/NOS Ⅱ) pathway damages the stria vascularis in cisplatin-treated mice〔J〕.Anticancer Rep,2002；22(6C)：4081-5.

7Masuda M，Nagashima R，Kanzaki S，etal.Nuclear factor-kappa B nuclear translocation in the cochlea of mice following acoustic overstimulation〔J〕.Brain Res，2006；1068(1)：237-47.

8Kim SJ，Lee JH，Kim BS，etal.Epigallocatechin-3-gallate protects against NO-induced ototoxicity through the regulation of caspase-1，Caspase-3，and NF-κB activation〔J〕.PLoS One，2012；7(9)：e43967.

9So H，Kim H，Lee JH，etal.Cisplatin cytotoxicity of auditory cells requires secretions of proinflammatory cytokines via activation of ERK and NF-κB〔J〕.J Assoc Res Otolaryngol，2007；8(3)：338-55.

10Chung WH，Boo SH，Chung MK，etal.Proapoptotic effects of NF-κB on cisplatin-induced cell death in auditory cell line〔J〕.Acta Otolaryngol，2008；128(10)：1063-70.

11宝东艳，王爱梅，李伟红，等.丹参对庆大霉素耳中毒豚鼠耳蜗NF-κB活性的影响〔J〕.中国现代医学杂志，2009；19(17)：2601-6.

12宝东艳，王爱梅，李伟红，等.丹参对庆大霉素致豚鼠螺旋神经节毒性的拮抗作用〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(4)：873-5.

13刘健民，马莉，何伟平.葛根素治疗突发性聋的疗效观察〔J〕.第一军医大学学报，2002；22(11)：1044-5.

14刘卫红，姚琦，王陈荣，等.葛根素注射液耳后注射联合声频共振治疗老年性聋疗效观察〔J〕.新中医，2013；45(3)：110-3.

〔2014-12-31修回〕

(编辑苑云杰/曹梦园)

基金项目：2014年度辽宁省科技厅自然科学基金(2014022026)；2013年辽宁省大学生创新创业训练计划项目(201310160015)；辽宁医学院校长基金项目-奥鸿博泽基金-大学生创新课题(2013D21)

〔中图分类号〕R764.5

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)11-2574-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.003

第一作者：宝东艳(1980-)，女，在读博士，讲师，主要从事听觉生理研究。