鱼金葶颗粒对AECOPD模型大鼠肺组织IL-8、TNF-α的影响*

宋欠红　樊睿　苏玉杰　李云华　朱虹江　陈丽娟　叶勇（云南中医学院第一附属医院，云南　昆明　650021）



鱼金葶颗粒对AECOPD模型大鼠肺组织IL-8、TNF-α的影响*

宋欠红樊睿苏玉杰李云华朱虹江陈丽娟叶勇
（云南中医学院第一附属医院，云南昆明650021）

【摘要】目的观察鱼金葶颗粒对慢性阻塞性肺病急性加重期（AECOPD）模型大鼠肺组织匀浆中细胞白介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的影响及病理组织分析。方法将Wistar大鼠72只，随机分为空白组、模型组和鱼金葶颗粒低、中、高剂量组及地塞米松对照组。采用烟雾吸入加脂多糖灌肺复合因素建立AECOPD大鼠模型。应用鱼金葶颗粒干预。采用ELISA法测定肺组织匀浆IL-8、TNF-α的含量。结果鱼金葶高剂量、中剂量组与模型组比较肺组织匀浆IL-8、TNF-α水平差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论鱼金葶颗粒对AECOPD模型大鼠肺组织匀浆中IL-8、TNF-α有明显的干预作用，能够有效降低IL-8、TNF-α的水平。

【关键词】鱼金葶颗粒AECOPD模型大鼠IL-8 TNF-α肺组织

慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种以免疫炎症为特征的疑难疾病。COPD急性加重期（AECOPD）病理机制复杂，多种因素导致的肺实质及肺血管慢性炎症是发病的关键。炎症细胞释放多种活性物质，参与慢性炎症的发生。本实验通过观察鱼金葶颗粒对AECOPD大鼠肺组织细胞白介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α （TNF-α）的影响及病理改变，探讨其对AECOPD的作用机理。现报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物取清洁级健康雄性Wistar大鼠72只，鼠龄16周，体质量260～300 g，由云南中医学院动物实验中心提供（大鼠合格证号：43006700006076）。动物饲养室为清洁级，控制温度（22±2）℃，实验前1周在实验环境中饲养。

1.2药物及试剂1）鱼金葶颗粒。组成为鱼腥草、金荞麦、葶苈子、川芎、桔梗、水蛭、地龙。规格为10 g/袋，每袋含生药10 g，由云南中医学院第一附属医院制剂室提供。成人每日用量为60 g，实验动物与成人用药量的换算方法：人用量（体质量70 kg）×0.018=大鼠（体质量200 g）用量。该方法计算结果为中剂量，其1/2剂量为低剂量组，2倍为高剂量组。2）试剂IL-8、TNF-α试剂盒。用酶联免疫吸附法，采用相应的ELISA检测试剂盒（TNF-α检测试剂盒购于晶美生物工程有限公司，IL-8检测试剂盒购于美国R&D公司）检测，按照试剂盒说明书操作。脂多糖购自广州齐云生物技术有限公司（由美国Sigma公司生产）。香烟购自昆明卷烟厂生产云烟牌香烟，焦油含量19 mg，尼古丁1.2 mg。地塞米松片购自广东三才石岐制药股份有限公司，规格0.75 mg/片。

1.3主要仪器AEU-210型电子天平，日本岛津厂；722型分光光度计，上海第二分析仪器厂；80-2型离心机，上海手术器械厂。

1.4动物模型制作参照宋一平等［2］采用烟雾吸入加脂多糖灌肺复合因素建立COPD大鼠模型。在造模的第1日、第14日将大鼠以10%水合氯醛2.4 mL/kg腹腔注射麻醉后，暴露喉头，以静脉套管针替代气管导管行气管插管，向大鼠气管内注入脂多糖（LPS）200 μg （μg/μL），完毕后将大鼠直立旋转5～10 s（旋转速度：1 周/秒），使LPS均匀分布于肺部。第2～13日、第15～28日，每日在有机玻璃密闭箱（80 cm×60 cm×50 cm，4个侧面均有一直径为1 cm的通气孔）持续吸入新鲜的香烟雾（昆明卷烟厂生产云烟牌香烟，焦油含量19 mg，尼古丁1.2 mg）30 min，10支/d，造模28 d结束。空白对照组仅在第1、14日气管内滴注等量的0.9%氯化钠注射液，置于正常无烟环境中饲养。

1.5分组及给药将大鼠随机分为空白组、模型组、鱼金葶颗粒低剂量组、鱼金葶颗粒中剂量组、鱼金葶颗粒高剂量组、地塞米松对照组。空白组大鼠正常饲养，每日灌服等量0.9%氯化钠注射液，其余组进行COPD造模。模型组在COPD造模的同时，亦正常饲养，每天灌服等量0.9%氯化钠注射液；鱼金葶颗粒低、中、高剂量组大鼠在制备COPD模型的同时，于每日熏香烟后按2.7 g/kg、5.4 g/kg、10.8 g/kg的剂量分别灌服鱼金葶颗粒；地塞米松对照组则给予醋酸地塞米松片0.9 mg/kg，灌服。

1.5标本制作和处理各组动物造模28 d结束后，先将动物称重，腹腔内注入10%水合氯醛（2.4 mL/kg）。麻醉生效后，将大鼠仰卧位固定，沿胸部正中线剪开皮肤和胸壁肌肉，剪断两侧肋骨和胸肌，暴露胸腔。迅速开胸分离肺脏，然后夹闭右肺，以0.9%氯化纳注射液3 mL灌洗左侧肺脏，松开右肺，夹闭左侧肺脏，用含有1/1000 DEPC的4%多聚甲醛溶液在20 cmH2O压力下进行灌注固定，30 min后投入多聚甲醛溶液中固定1周。取固定好的组织，在最大横径处切3 mm厚的组织块，常规脱水，二甲苯透明，用自动石蜡包埋机包埋，切成4 μm厚的切片，进行常规苏木素-伊红（HE）染色，光镜下观察肺组织病理改变，研磨肺组织取上清液进行IL-8、TNF-α检测。

1.6统计学处理应用SPSS16.0统计软件分析。计量资料以（x±s）表示，采用方差分析进行统计学处理。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组肺组织匀浆IL-8、TNF-α水平的比较见表1。结果示鱼金葶颗粒低、中、高剂量组IL-8比模型组有较好抑制作用（P＜0.05）；鱼金葶颗粒中、高剂量组TNF-α比模型组有较好抑制作用（P＜0.05）；IL-8、TNF-α在鱼金葶颗粒中、高剂量组与地塞米松对照组比较均有统计学差异（P＜0.05）。

表1　各组大鼠肺组织匀浆IL-8、TNF-α水平比较（pg/mL，±s）

表1　各组大鼠肺组织匀浆IL-8、TNF-α水平比较（pg/mL，±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别　n　IL-8　TNF-α空白组　10　12.31±2.64　773.2±188模型组　12　24.42±4.01　978.5±39.78鱼金葶颗粒低剂量组　11　18.10±5.86*　908.1±77.72鱼金葶颗粒中剂量组　11　15.69±4.80*　842.1±76.83*鱼金葶颗粒高剂量组　12　13.81±4.08**　821.8±114.6**地塞米松对照组　11　21.38±8.29　895.8±37.44

2.2各组大鼠病理比较见图1～图5。所建COPD模型的病理学改变符合人类COPD的特点。空白组大鼠活泼好动，皮毛光泽无脱落；模型组及鱼金葶干预组大鼠毛发失去光泽，黄涩，神情倦怠，活动能力下降。模型组呈慢性支气管炎、肺气肿的特征性病理学改变；鱼金葶干预组大鼠支气管肺组织损伤的程度较模型组轻。与空白对照组比较，模型组气道壁增厚，鱼金葶干预组与模型组比较气道壁变薄。

图1　空白组：肺组织未见炎性细胞浸润，支气管管腔规则，气道黏膜上皮及肺泡结构完整，肺泡间隔窄，气道平滑。肌薄，肺泡腔透亮，无上皮脱落损伤，黏膜无水肿。

图2　模型组：肺组织病理切片可见杯状细胞及平滑肌增生，基底膜增厚且形态不规则，支气管管腔内可见黏液栓，气道有损伤、断裂，肺泡间隔不同程度增宽，部分断裂，支气管与血管周围大量炎症细胞浸润。

图3　鱼金葶颗粒低剂量组：支气管上皮结构较完整，肺泡间隔窄，肺泡腔内透亮，无明显炎性渗出，内无明显分泌物，支气管及肺泡炎性细胞浸润较轻。

图4　鱼金葶颗粒中剂量组：支气管上皮结构较完整，肺泡壁变薄，相互融合成大小不一的气囊腔，肺泡腔内透亮，无明显炎性渗出，支气管及肺泡炎性细胞浸润较轻。

图5　鱼金葶颗粒高剂量组：支气管上皮结构较完整，肺泡间隔窄，支气管及肺泡炎性细胞浸润较轻。部分肺泡壁变薄、融合。

3　讨论

在烟熏加脂多糖造模过程中，可能出现大鼠首次接触烟熏不能耐受的情况，出现6只死亡。所以在正式实验中，开始烟熏从15 min开始，每2日延长烟熏时间5 min最终至烟熏时间为30 min/次。这样可以减少大鼠的死亡，该组实验发现，在低剂量烟熏并延长烟熏时间至42 d造模方法，可以更好地模拟人COPD形成的过程。

AECOPD趋化物质尤其是TNF-α、IL-8在肺组织中表达。其病理机制复杂，多种因素导致的肺实质及肺血管慢性炎症是发病的关键。炎症细胞释放多种活性物质，参与慢性炎症的发生。IL-8、TNF-α是其中较重要的炎性因子。支气管、肺组织的炎症、损伤、修复、重塑是COPD不断进展的病理基础，细胞外基质过度沉积与小气道平滑肌层增厚共同构成COPD气道重塑的病理基础。

该研究发现，鱼金葶颗粒具有明确的抗炎，抑制炎性介质的作用，对于肺组织匀浆中的TNF-α、IL-8与模型组对比均有统计学意义。根据单味药药理研究表明，方中鱼腥草、金荞麦、葶苈子等药具有抗炎、抑制炎性介质的作用，川芎、水蛭、地龙具有活血化瘀改善微循环，缓解支气管痉挛作用。该方配伍使用后，能够起到清热化痰、活血化瘀、宣肺止咳的作用，能够显著抑制炎性介质的释放。

但其量效关系尚不明确，可以进一步观察鱼金葶颗粒的量效关系及毒副作用。

参考文献

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·研究报告·

·研究报告·

Effects and Pathological Analysis of Yujinting Granule on IL-8 and TNF-α of Lung Tissue in AECOPD Rat Model

SONG Qianhong，FAN Rui，Su Yujie，et al.The First Affiliated Hospital of Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Yunnan，Kunming 650021，China.

【Abstract】Objective：To observe the effects and pathological analysis of Yujinting granule on IL-8 and TNF-α of lung tissue in AECOPD rat model.Methods：72 Wistar rats were randomly divided into the blank group，the model group，Yujinting granule low，mid and high dose groups and dexamethasone group.The smoke inhalation and lipopolysaccharide lung perfusion of complex factors were used in the establishment of rat model of acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease（AECOPD）.Yujinting granule intervention was applied.ELISA was used to determine IL-8 in lung tissue homogenate and TNF-α content.Results：In the comparison among Yujinting granule high dose，middle dose group and the model group in IL-8 in lung tissue homogenate and TNF-α，there was statistically significant difference（P＜0.05）.Conclusion：Yujinting granule has a significant intervention effect on IL-8 and TNF-αof lung tissue homogenate in AECOPD rat models.

【Key words】Yujinting granule；AECOPD rat model；IL-8；TNF-α；Lung tissue

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：1004-745X（2016）04-0588-03

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.04.007

*基金项目：云南省科技计划项目（2013FZ208）

收稿日期（2015-12-20）