炎调方抑制LPS诱导人肺泡上皮细胞炎症因子释放机制研究*

施荣　王倩　韩丹　熊旭东（上海中医药大学附属曙光医院，上海　201203）



炎调方抑制LPS诱导人肺泡上皮细胞炎症因子释放机制研究*

施荣王倩△韩丹熊旭东
（上海中医药大学附属曙光医院，上海201203）

【摘要】目的体外观察炎调方通过NF-κB信号通路调控内毒素（LPS）诱导的人肺泡上皮（A549）细胞中炎症因子的释放。方法采用炎调方药物血清方法，观察其对A549细胞的作用效果及其机制。MTT法观察细胞存活率；双抗体夹心酶联合免疫吸附法（ELISA法）检测细胞中白介素-8（IL-8）和前列腺素E2（PGE2）的表达；Western blot法检测环加氧酶2（COX2）和NF-κB的表达；运用NF-κB特异性抑制剂与炎调方联合运用，观察NF-κB信号通路对COX2的调控作用。结果LPS明显抑制了A549细胞增殖，炎调方药物血清（炎调方药物血清）能缓解LPS的细胞毒性；炎调方药物血清明显降低了LPS诱导的IL-8、PGE2和COX2释放和表达。炎调方药物血清通过NF-κB信号通路调控COX2表达。结论炎调方通过NF-κB信号通路调控LPS的细胞毒性和炎症因子释放。

【关键词】炎调方人肺泡上皮炎症因子NF-κB信号通路

脓毒症（Sepsis）是具有感染依据的全身炎症反应综合征。严重脓毒症导致的多器官功能障碍是重症医学面临的重要临床难题，病死率可高达80%［1］。脓毒症早期便可导致急性肺损伤（ALI），肺泡上皮细胞在多种炎症因子的作用下，可发生弥漫性损害，影响气体交换，最终进展为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。我们早期动物实验结果显示，炎调方能调控脓毒症大鼠血清中炎症因子释放，保护肺组织［2-3］。本实验采用内毒素（LPS）干预人肺泡上皮细胞A549，造成急性肺损伤细胞模型，观察炎调方药物血清对A549的保护作用，并从NF-κB信号通路探讨其机制。现报告如下。

1　材料与方法

1.1试药与仪器1）炎调方由桃仁、生大黄、芒硝、玄参、赤芍、当归等组成，均符合2005版《中国药典》规定并加工炮制合格的饮片，由上海中医药大学附属曙光医院中药房提供。煎煮方法：加10倍体积蒸馏水将饮片浸泡30 min，先煮桃仁、玄参、赤芍、当归，沸腾后继续煎煮20 min，起锅前10 min加入大黄，第2煎加6倍体积的蒸馏水煎煮，沸腾后继续煎煮20 min。2次煎液混合，用4层无菌纱布过滤，芒硝最后纳入药液中充分溶解，药液最后浓缩成含生药1.0 g/mL。2）DMEM培养基（美国GIBCO公司）；胎牛血清（FBS，美国GIBCO公司）；噻唑蓝（MTT，美国Sigma公司）；二甲基亚砜（DMSO，美国Sigma公司）；LPS和PDTC（美国Sigma公司）；抗体COX2（sc-23984，goat polyclonal，1∶800）和NF-κB p65（sc-372，rabbit polyclonal，1∶200）（美国Santa Cruz公司）；抗体GAPDH（kc-5G4，mouse polyclonal，1∶10000）（中国康成公司）；抗体human toll-like receptor 4（TLR4）antibodies（14-9917-80，mouse monoclonal，25 μg）（美国eBioscience公司）；白介素-8（IL-8）和前列腺素E2（PGE2）的ELISA试剂盒（美国R&D公司）。3）CO2细胞恒温培养箱（美国Thermo Forma公司）；Healforce生物安全柜（香港力康发展有限公司）；OLYMPUS CKX41倒置显微镜（日本OLYMPUS公司）；台式离心机（日本KUBOTA公司）；Odyssey红外荧光扫描成像系统（美国Li-cor公司）；Syergy2酶联免疫检测仪（美国Biotek公司）。1.2实验动物SD大鼠，清洁级，体质量200 g，购自中国科学院，饲养于上海中医药大学动物实验中心。

1.3药物血清的制备将SD大鼠随机分为炎调方组和阴性对照组，每组8只。实验前禁食12 h，炎调方组以9.9 g/kg水煎液剂量灌胃，阴性对照组灌等体积的0.9%氯化钠注射液。连续给药3 d，每日分早、晚两次给药，于第4日第1次灌胃1 h后（灌药前禁食不禁水12 h）采血。无菌条件下腹总动脉采血，静置2 h，4000 r/min，离心10 min，分离血清（药物血清）。同种条件血清混匀，于56℃水浴30 min灭活，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存备用。临用前，将各组药物血清分别加入DMEM培养液，配制成浓度为5%、10%、20%含药物血清培养液。

1.4细胞培养人肺泡上皮细胞A549和人巨噬细胞THP-1购于中国科学院上海细胞库。A549和THP-1细胞种植在DMEM完全培养基（含10%FBS、0.01 mg/mL Insulin，100 U/mL、青链霉素混合液，20 mmol/L HEPES）中，细胞在37℃、5%CO2环境中单层生长，实验时取对数生长期的细胞。

1.5细胞增殖检测取1×105个/mL A549细胞接种于96孔板，培养至第2日细胞贴壁后，LPS 1、10、100 μg/mL分别干预A549细胞6、12、24 h；血清用10%、20%、30%炎调方药物血清作为处理组剂量，相应浓度的无药物血清作为阴性对照组，每组设4个复孔，孵育细胞12 h。将MTT用无血清DMEM培养液配成0.5 mg/mL溶液（5 mg/mL，即0.5%MTT），每孔加20 μL，37℃温育4 h，小心吸出孔内上清液，加入150 μL DMSO，用全自动酶标仪在490 nm处测定各孔OD值。用下列公式计算药物血清对细胞生长的抑制率，并绘制效应曲线，同样的实验重复3次。细胞生存率（%）=（OD药物-OD空白）/（OD对照-OD空白）×100%

1.6Western blot实验裂解组织提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度，Western blot法检测COX2、NF-κB及GAPDH蛋白的表达。常规SDS-PAGE电泳、转膜、封闭，分别将膜稀释好的一抗（1∶1000，5%脱脂奶粉稀释）封入杂交袋内，4℃摇荡过夜。然后，分别将膜稀释好的荧光二抗（1∶10000稀释）封入杂交袋内，避光室温摇荡1 h。Odyssey红外荧光扫描成像系统读膜。

1.7ELISA实验严格按试剂盒要求操作，双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞中白介素-8（IL-8）和前列腺素E2（PGE2）的释放量，ELISA试剂盒为R&D公司原装产品，由上海森雄科技实业有限公司提供。

2　结果

2.1LPS对肺泡上皮细胞A549存活率的影响见表1。为了观察LPS对A549细胞的毒性，分别应用LPS1、10和100 μg/mL处理细胞6、12和24 h。MTT法观察细胞存活率，实验结果显示LPS质量为10 μg/mL 和100 μg/mL呈时间-剂量依赖性抑制了A549细胞增殖，与未处理组差异有统计学意义（P＜0.05）。其中10 μg/mL LPS干预A549细胞6、12和24 h，其细胞存活率分别为80%、61%与22%。LPS 10 μg/mL干预A549细胞12 h用于进行后续实验。

表1　不同浓度LPS在不同时间点对A549细胞存活率的影响（±s）

表1　不同浓度LPS在不同时间点对A549细胞存活率的影响（±s）

与对照组比较，△P＜0.05。下同。

组别　n　24 h LPS 100 μg/mL组　9.88±2.67△未处理细胞对照组LPS 1 μg/mL组　92.74±4.69△LPS 10μg/mL组　22.29±3.99△6 h　12 h 67.23±4.26 30.18±1.57△100±3.18 99.97±2.75 96.12±4.01△80.13±7.01 60.85±2.61△

2.2炎调方药物血清对肺泡上皮细胞A549存活率的影响见表2。MTT法检测不同浓度炎调方药物血清干预A549细胞12 h的存活率，同时以正常大鼠血清作对照。实验结果显示，炎调方药物血清10%、20%与30%均未表现任何细胞毒性。因此炎调方药物血清10%、20%与30%用于改善LPS 10 μg/mL致细胞增殖抑制实验。与单独运用LPS 10 μg/mL相比，炎调方药物血清10%、20%与30%分别将细胞存活率提高了20.6%、25.9%与28.9%（P＜0.05）。实验结果表明，炎调方能改善LPS导致的A549细胞损伤。

2.3炎调方药物血清对LPS诱导A549细胞释放IL-8和PGE2的影响见表3。为了观察炎调方药物血清对LPS诱导的IL-8和PGE2释放量的影响，将LPS分别与炎调方药物血清10%、20%及30%联合运用。采用ELISA方法检测IL-8和PGE2的表达水平。单独运用LPS 10 μg/mL明显增加了A549细胞中IL-8和PGE2的含量。而炎调方药物血清20%和30%分别致LPS诱导的IL-8含量降低了约31%和50%；PGE2的含量分别降低了34%和48%（P＜0.05）。其中细胞表面的LPS受体TLR4作为阳性对照。LPS诱导的IL-8和PGE2均被TLR4抑制。

表2　炎调方药物血清对LPS致A549细胞损伤的改善作用（%，±s）

表2　炎调方药物血清对LPS致A549细胞损伤的改善作用（%，±s）

与LPS比较，*P＜0.05。下同。

组别　n正常对照组LPS 10 μg/mL组10%炎调方药物血清组存活率100.00±4.83 59.30±3.67 95.24±1.39 20%炎调方药物血清组　94.21±3.88 30%炎调方药物血清组　97.40±1.28 LPS+10%炎调方药物血清组　79.93±4.24*LPS+20%炎调方药物血清组　85.22±2.23*LPS+30%炎调方药物血清组　88.25±3.41*

表3　炎调方药物血清对LPS诱导IL-8和PGE2释放的缓解作用（pg/mL，±s）

表3　炎调方药物血清对LPS诱导IL-8和PGE2释放的缓解作用（pg/mL，±s）

组别　n正常对照组LPS 10 μg/mL组10%炎调方药物血清组20%炎调方药物血清组30%炎调方药物血清组LPS+Anti-TLR4组IL-8　PGE226.67±5.01　23.50±3.39 712.50±56.90　60.83±5.34 650.17±53.86　54.83±4.26 494.67±31.15*　40.17±3.31*355.33±49.96*　31.50±4.51*301±35.97*　28.17±4.62*

2.4炎调方药物血清对LPS诱导A549细胞中COX2表达量的影响为了观察炎调方药物血清对LPS诱导COX2表达量的影响，将LPS分别与炎调方药物血清10%、20%及30%联合运用。采用Western blot方法检测COX2的表达水平。实验结果如图1所示，与未处理的细胞对照组比较，LPS显著诱导了COX2高表达。而当LPS分别与炎调方药物血清10%、20%及30%联合运用时，COX2的高表达量呈剂量依赖性被抑制。为了观察炎调方药物血清对COX2的作用是否特异性地针对A549细胞，笔者运用LPS干预人巨噬细胞THP-1，发现炎调方药物血清同样降低了LPS诱导的COX2高表达，但其作用不及A549细胞中明显。

图1　炎调方药物血清对LPS诱导COX2高表达的抑制作用

2.5炎调方药物血清通过NF-κB信号通路抑制COX2表达实验结果如图2A所示，LPS诱导了A549细胞中NF-κB（p65）的表达，炎调方药物血清20%和30%明显抑制了LPS诱导的NF-κB（p65）的高表达。而在THP-1细胞中炎调方药物血清调控NF-κB（p65）的作用不明显。为了进一步证实炎调方药物血清对COX2的抑制作用主要通过NF-κB信号通路，笔者运用了NF-κB特异性抑制剂PDTC。结果显示，PDTC逆转了炎调方药物血清对高表达量COX2的抑制作用（图2B）。因此笔者推断，炎调方药物血清通过NF-κB信号通路抑制COX2表达。

图2　炎调方药物血清通过NF-κB信号通路调控COX2表达

3　讨论

严重脓毒症可诱发多脏器功能障碍综合征（MODS）。肺是最易受损的器官，其发生率约为40%［4］，病死率约为30%～50%［5］。失控的炎症反应或毒素可激活多种炎性细胞在肺组织聚集、活化，造成肺泡上皮细胞弥漫性损伤，肺泡表面活性物质减少，以肺容积减少、顺应性降低、严重的通气/血流比例失调为病理特征，临床表现为进行性低氧血症。

肺泡上皮细胞可分为Ⅰ型和Ⅱ型，是覆盖于肺泡表面的一层上皮细胞。肺泡上皮细胞通过合成和分泌表面活性物质，维持肺泡的稳定性、保持肺泡表面水电解质平衡等，起到维持肺组织正常的气体交换功能。感染导致LPS的大量和持续释放是导致ALI发生、发展的主要因素之一。LPS可直接刺激肺泡上皮，产生多种气道趋化性细胞因子。IL-8是多形核细胞和T淋巴细胞激活趋化因子。IL-8的释放可趋化中性粒细胞（PMN）在肺聚集，促进PMN的趋化、变形、脱颗粒、释放溶酶体酶等参与炎症反应；巨噬细胞炎症蛋白-2 （MIP-2）在PMN向肺泡内募集机制中起重要作用，其

最主要的趋化性细胞因子也是IL-8［6］。LPS导致的ALI过程中，IL-8浓度呈持续升高，肺泡灌洗液中IL-8含量在PMN聚集之前即增高。COX2是花生四烯酸合成前列腺素的重要限速酶，花生四烯酸及其代谢产物在急性肺损伤中作用复杂［8］。COX-2主要分布在肺巨噬细胞和肥大细胞，生理状态下，肺组织内COX-2仅有少量表达，ALI肺组织COX-2表达明显增高，COX-2浓度与肺损伤程度呈明显正相关。PGE2是一种常见的前列腺素，具有广泛的生理和病理功能，是炎症、疼痛、发热反应中的重要介质［7］。多种细胞因子可诱导COX-2表达及PGE2合成，参与肺损伤。NF-κB通过参与多种细胞因子基因的转录，而对这一调控网络产生复杂的影响。激活的NF-κB可增强细胞因子的转录，使炎症细胞合成炎症因子的时间和数量得以增高［9］。因此，NF-κB是核内炎性递质基因转录的开关。本研究结果显示，LPS可诱导肺泡上皮细胞A549中IL-8、PGE2和COX2的释放，炎调方药物血清可降低LPS诱导的IL-8 和PGE2释放量以及COX2的表达，缓解炎症趋化因子和炎症介质的释放可能是炎调方药物血清抗炎的作用机制之一。炎调方药物血清可抑制LPS诱导A549细胞的NF-κB活性，炎调方药物血清可能通过此途径减少炎症介质的产生，减轻炎症介质对肺的损伤。

脓毒症在中医学理论体系中并无相应的病名，属于中医学“温热病”范畴［10］。脓毒症早期主要以身灼热、烦渴、腹胀便秘为主症，甚或出现斑疹隐隐、神昏谵语，舌绛少津，苔黄，脉数等症。自拟炎调方由桃仁、生大黄、芒硝、玄参、赤芍、当归等组成，具有通腑活血、凉营解毒之功。全方切中脓毒症腑实、营热、血瘀之根本病机。前期临床研究证实，炎调方通腑活血、凉营解毒，对脓毒症有良好疗效［11］。动物实验中，炎调方能通过NF-κB通路，调控脓毒症大鼠血清中炎症因子IL-6和IL-10的释放［2-3］，保护肺组织。本研究采用体外药物血清方法，进一步研究炎调方的作用机制，为其药理研究提供一定的实验依据。

参考文献

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·研究报告·

·研究报告·

Mechanism of Yantiaofang inhibiting LPS induced inflammatory cytokines release in human alveolar epithelial cells

SHI Rong，WANG Qian，HAN Dan，et al.Shuguang Hospital Affiliated with University of T.C.M，Shanghai 201203，China

【Abstract】Objective：To observe the release of inflammatory cytokines in the LPS induced human alveolar epithelial（A549）cells through NF-κB signaling pathway in vitro.Methods：The effect and mechanism of A549 cells were observed by the method of drug serum with Yantiaofang.Cell survivals were observed by MTT assay.The levels of IL-8 and PGE2 were detected by ELISA assay.The expressions of COX2 and NF-κB were detected by Western blot analysis.The regulatory effect of NF-κB signaling pathway on COX2 was observed by using the combination of the specific inhibitor of NF-κB and Yantiaofang.Results：LPS significantly inhibited the proliferation of A549 cells.Moreover，the cytotoxicity of LPS can alleviate by the drug serum with Yantiaofang（YTF）.YTF significantly reduced the release of IL-8，PGE2and COX2 release induced by LPS.The expression of COX2 was regulated by YTF through NF-κB signaling pathway.Conclusion：Yantiaofang regulates LPS induced cytotoxicity and inflammatory cytokine release by NF-κB signaling pathway.

【Key words】Yangtiaofang；Alveolar epithelial cell；Inflammatory factors

中图分类号：R631

文献标志码：A

文章编号：1004-745X（2016）04-0572-04

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.04.003

*基金项目：上海市科学技术委员会科研计划项目（15ZR1442000）

通信作者△（电子邮箱：doctorshi@126.com）

收稿日期（2015-11-20）