瑞舒伐他汀对心肌梗死大鼠左心房交感神经重构的影响Δ

路清华，顾明明，魏长春，路　鹏，刘　锦

(1.山东省泰山医院药剂科，山东 泰安　271000； 2.山东省宁阳县第一人民医院中医科，山东 泰安　271000； 3.山东省泰山医院护理部，山东 泰安　271000； 4.山东省泰山医院心内科，山东 泰安　271000)

瑞舒伐他汀对心肌梗死大鼠左心房交感神经重构的影响Δ

路清华1*，顾明明2，魏长春3，路鹏1，刘锦4#

(1.山东省泰山医院药剂科，山东 泰安271000； 2.山东省宁阳县第一人民医院中医科，山东 泰安271000； 3.山东省泰山医院护理部，山东 泰安271000； 4.山东省泰山医院心内科，山东 泰安271000)

摘要目的：探讨瑞舒伐他汀对心肌梗死(myocardial infarction，MI)大鼠左心房交感神经重构的影响及其作用机制。方法：将60只雄性Wistar大鼠随机均分为3组：假手术组(Sham组)，MI+瑞舒伐他汀干预组(Rstatin组)及MI组。采用免疫组化法分析3组大鼠左侧星状神经节(left stellate ganglion，LSG)及左心房组织中神经生长因子(nerve growth factor，NGF)和生长相关蛋白43(growthassociated protein 43，GAP-43)阳性物质含量以反映神经纤维的分布和密度，采用Western blot法检测两者的蛋白含量。结果：Rstatin组和MI组大鼠LSG与左心房组织中GAP-43及NGF阳性神经密度均明显高于Sham组，差异有统计学意义(P<0.01)；但Rstatin组明显低于MI组，差异有统计学意义(P<0.01)。Rstatin组和MI组大鼠LSG及左心房组织中GAP-43蛋白表达均明显高于Sham组，差异有统计学意义(P<0.01)；但Rstatin组明显低于MI组，差异有统计学意义(P<0.01)。Rstatin组和MI组大鼠LSG及左心房组织中NGF蛋白表达均明显高于Sham组，差异有统计学意义(P<0.01)；但Rstatin组与MI组的差异无统计学意义(P>0.05)。结论：瑞舒伐他汀可有效改善MI大鼠左心房交感神经重构，其机制可能与直接抑制LSG内GAP-43及左心房组织中NGF的表达及蛋白生成有关。

关键词心肌梗死； 瑞舒伐他汀； 交感神经重构

心脏由内在及外在自主神经支配，星状神经节在功能上属于交感神经节，左侧星状神经节(left stellate ganglion，LSG)的兴奋性增强可增加心律失常的易感性。心肌梗死(myocardial infarction，MI)后会出现去神经化、神经出芽及过度再生，即神经重构现象[1]。研究结果显示，MI后心脏神经重构能促进房性快速心律失常，尤其是心房颤动的发生[2-3]。近年来，他汀类药物的多效性备受关注，除调节血脂作用外，其抗心律失常及防止心脏重构等作用屡有报道[4-5]。Cao等[6]的大型临床试验结果已证实他汀类药物具有抗心律失常作用，但具体机制仍不十分明确。本研究旨在探讨MI后心脏是否发生内在及外在自主神经重构，以及瑞舒伐他汀对大鼠MI后心房神经重构的影响及其可能的机制。

1材料与方法

1.1动物模型建立和分组

选60只清洁级(SPF)雄性Wistar大鼠，体质量250 g左右，随机分为假手术组(Sham组)、MI+瑞舒伐他汀干预组(Rstatin组)、MI组，每组均为20只。MI组和Rstatin组大鼠制作MI模型：腹腔麻醉后，开胸暴露心脏，用6/0的细针穿线结扎前降支，观察到远端心肌变白、左心房充盈以明确MI形成后，逐层关胸。Sham组大鼠只在相同部位穿线但不结扎。Rstatin组大鼠在MI后给予瑞舒伐他汀(无锡阿斯利康)10 mg/(kg·d)灌胃，Sham组和MI组大鼠给予相应量的0.9%氯化钠注射液，共4周。

1.2心肌组织标本的留取

术后第4周处死各组大鼠后迅速取出心脏，用0.9%氯化钠注射液冲洗干净，取LSG及面积为0.4～0.6 cm2的左心房心肌，部分置于中性甲醛中固定1 h，然后置于甲醛中保存；部分储存于液氮中集中行Western blot和逆转录-聚合酶链反应检测。

1.3免疫组化法测定生长相关蛋白43(growthassociated protein 43，GAP-43)及神经生长因子(nerve growth factor，NGF)阳性神经纤维

从甲醛中取出组织，进行脱水、浸蜡、包埋及切片，切片厚度为3 μm。切片于60 ℃预热30 min，脱蜡，以枸橼酸钠高温抗原修复2 min，3%H2O2反应10 min以阻断内源性过氧化物酶。分别滴加一抗为GAP-43抗体1∶1 000(英国Abcam公司)及NGF抗体1∶1 000(英国Abcam公司)，于4 ℃下孵育过夜。然后滴加二抗，以DAB显色试剂盒显色，棕色颗粒为GAP-43/NGF阳性染色物质。使用计算机辅助形态计量分析系统(Image-Pro Plus 6.0)测定阳性染色的平均光密度(average optical density，AOD)，据此比较组间阳性染色物质的差异。

1.4Western Blot测定GAP-43、NGF蛋白表达

取适量蛋白质样品进行电泳后转印到聚偏二氟乙烯膜、5%脱脂奶粉，于37 ℃封闭1 h后加入兔多克隆GAP-43、NGF一抗1∶1 000(英国Abcam公司)及小鼠单克隆甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗1∶1 000(英国Abcam公司)于4 ℃下孵育120 min，分别加入相应二抗孵育90 min，充分洗涤后与增强化学发光试剂(美国NEN公司)反应，以增强化学发光法曝光显色[LAS-4000mini化学发光成像分析仪，通用电器医疗(日本)公司]，使用LAS-4000mini2200凝胶成像仪[通用电器医疗(日本)公司]采集图片。以GAPDH为内参照，计算目的蛋白与同步GAPDH灰度值的比值作为相对表达量。

1.5统计学方法

2结果

2.14周后3组大鼠LSG及左心房组织交感神经再生现象

Rstatin、MI组大鼠LSG及心房区GAP-43、NGF阳性染色的AOD均明显高于Sham组，差异有统计学意义(P<0.01)，且空间分布更加紊乱，神经纤维的走向与心肌细胞的排列不一致，部分神经纤维粗大；Rstatin组大鼠GAP-43和NGF阳性染色的AOD均明显低于MI组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1～2及图1～2。

表13组大鼠左心房组织GAP-43及NGF阳性染色的

注：与Sham组比较，*P<0.01；与Rstatin组比较，△P<0.01

Note：vs. the sham group,*P<0.01; vs. the rstatin group,△P<0.01

表2　3组大鼠LSG中GAP-43及NGF阳性染色的

注：与Sham组比较，*P<0.01；与Rstatin组比较，△P<0.01

Note：vs. sham group,*P<0.01; vs. Rstatin group,△P<0.01

A. Sham组GAP-43染色；B.Rstatin组GAP-43染色；C.MI组GAP-43染色；D.Sham组NGF染色；E.Rstatin组NGF染色；F.MI组NGF染色A.GAP-43 staining in sham group；B.GAP-43 staining in rstatin group；C.GAP-43 staining in MI group；D.NGF staining in sham group；E.NGF staining in rstatin group；F.NGF staining in MI group图1　3组大鼠心房组织中GAP-43及NGF阳性物质分布Fig 1　Distribution of GAP-43 in atrial tissue and positive density of NGF

A. Sham组GAP-43染色；B.Rstatin组GAP-43染色；C.MI组GAP-43染色；D.Sham组NGF染色；E.Rstatin组NGF染色；F.MI组NGF染色A.GAP-43 staining in sham group；B.GAP-43 staining in rstatin group；C.GAP-43 staining in MI group；D.NGF staining in sham group；E.NGF staining in rstatin group；F.NGF staining in MI group图2　3组大鼠LSG中GAP-43及NGF阳性物质分布Fig 2　Distribution of GAP-43 in LSG and positive density of NGF

A.3组大鼠左心房GAP-43蛋白表达；B.3组大鼠左心房NGF蛋白表达；C.3组大鼠LSG中GAP-43蛋白表达；D.3组大鼠LSG中NGF蛋白表达；*P<0.01；LA.左心房A.expression of GAP-43 protein in LA of three group of rats；B.expression of NGF protein in left atrium of three group of rats；C.expression of GAP-43 protein in LSG of three group of rats；D.expression of NGF protein in LSG of three group of rats；*P<0.01；LA.left atrium图3　左心房组织及LSG中GAP-43、NGF蛋白表达Fig 3　Expression of GAP-43 protein and NGF protein in LA and LSG

2.24周后3组大鼠左心房组织及LSG中GAP-43、NGF蛋白表达

MI、Rstatin组大鼠左心房组织及LSG中GAP-43、NGF蛋白表达水平均明显高于Sham组，差异均有统计学意义(P<0.01)；Rstatin组大鼠左心房组织及LSG中GAP-43蛋白表达水平均明显低于MI组，差异均有统计学意义(P<0.01)，而NGF蛋白表达水平的差异无统计学意义(P>0.05)，见图3。

3讨论

近年来研究结果发现，MI时可伴有心脏及星状神经节的神经损伤及修复反应，导致神经再分布和高支配现象，这种交感神经的高支配可引起心房颤动等多种心律失常[7]。这种交感神经高支配现象的发生机制较为复杂，尽管心脏神经出芽及过度再生机制还不是十分清楚，但有研究结果表明，受损心肌及炎症组织合成并释放的NGF在神经重构中起着重要的作用[8-9]。NGF是机体重要的神经营养因子之一，能促进交感神经的发育与分化，加强神经系统损伤后的再生修复，而抑制NGF表达则会减少MI后组织交感神经的生长[10]。NGF能促进心脏交感神经的生长及受损去甲肾上腺素能神经元的再生，因此，其可能参与MI后交感神经失支配、再生和过度支配过程，进而与MI后心律失常的发生密切相关[6]。GAP-43是一种胞膜磷酸蛋白，与神经发育、突触形成和可塑性，特别是与神经再生密切相关。有学者认为，NGF可能促使GAP-43在生长锥中磷酸化，转染人GAP-43 cDNA的PC12细胞对NGF的敏感性增加10倍，神经突起再生作用显著提高，而且周围神经损伤后，GAP-43含量可增加20～100倍[11-13]。在特定的条件和环境下，周围神经轴突的再生与GAP-43有着十分密切的关系，因周围神经的再生需要合成数种与神经再生相关的蛋白质，而GAP-43就是其中较重要的一种，可以被认为是周围神经再生的标志[14-15]。

本研究结果显示，MI后左心房和LSG均发生了交感神经重构。最近有研究发现，单纯左心室MI后心房出现神经过度再生，心房颤动诱发率也相应增高[2，13]。本研究同样发现左心室MI导致心脏神经纤维密度显著增加，分布紊乱。有研究显示，MI可引起LSG的NGF及GAP-43含量增多，而NGF mRNA并未增加，这提示LSG中增加的NGF可能是由梗死区域心肌组织产生并经神经轴突逆向转运而来的[1]。本研究发现MI大鼠心房内蛋白的相对表达量比Sham组明显增加。本研究对大鼠MI后心房中NGF蛋白表达及交感神经支配进行研究，结果提示心肌细胞表达的NGF蛋白在MI后交感神经重构过程中发挥了重要作用。本研究证实由于LSG的神经广泛分布于整个心脏，其增加的GAP-43可在心脏整体水平促进交感神经再生。他汀类药物在心血管疾病中的应用已相当广泛，这可能与其多效性有关，如改善心室重构及抗心律失常，这些作用有益于改善MI患者的预后。心脏神经重构也能促进心房颤动发生，而他汀类药物被证明可通过抗炎作用降低房性心律失常的诱发率[3，16]。此外，有研究发现，阿托伐他汀具有改善MI大鼠交感神经重构的作用[17]。尽管单独使用辛伐他汀不能使心脏神经重构完全恢复到正常状态，但明显好于未用药组，提示他汀类药物在MI患者中的应用是必要的。

综上所述，瑞舒伐他汀通过改善大鼠MI后心房神经重构而起到预防房性快速心律失常的作用，其机制可能与其在LSG及心房组织中使NGF及GAP-43表达下调有关，这为他汀类药物在MI后的临床应用提供了进一步的理论基础。然而，MI后心房交感神经的再生过程非常复杂，GAP-43的阳性表达仅提示神经的再生反应，并不意味着一定就有成功的再生，而缺乏GAP-43表达也并非意味着轴突生长完全抑制。GAP-43的特性、GAP-43与NGF之间的关系及如何促进MI后心房交感神经的重构尚有待于进一步研究。

参考文献

[1]Zhou S，Chen LS，Miyauchi Y，et al.Mechanisms of cardiac nerve sprouting after myocardial infarction in dogs[J].Circ Res，2004，95(1)：76-83.

[2]Chen PS，Tan AY.Autonomic nerve activity and atrial fibrillation[J].Heart Rhythm，2007，4(3 Suppl)：S61-S64.

[3]Numata A，Miyauchi Y，Ono N，et al.Spontaneous atrial fibrillation initiated by tyramine in canine atria with increased sympathetic nerve sprouting[J].J Cardiovasc Electrophysiol，2011，23(4)：415-422.

[ 4]Liu YB，Lee YT，Pak HN，et al.Effects of simvastatin on cardiac neural and electrophysiologic remodeling in rabbits with hyperchol-esterolemia[J].Heart Rhythm，2009，6(1)：69-75.

[5]He XZ，Zhou SH，Wan XH，et al.The effect of early and intensive statin therapy on ventricular premature beat or non-sustained ventric-ular tachycardia in patients with acute coronary syndrome[J].Cardiol J，2010，17(4)：381-385．

[6]Cao JM，Chen LS，Kenknight BH，et al.Nerve sprouting and sudden cardiac death[J].Circ Res，2000，86(7)：816-821.

[7]Nguyen BL，Li H，Fishbein MC，et al.Acute myocardial infarction induces bilateral stellate ganglia neural remodeling in rabbits[J].Cardiovasc Pathol，2012，21(3)：143-148.

[8]Oh YS，Jong AY，Kim DT，et al.Spatial distribution of nerve sprouting after myocardial infarction in mice[J].Heart Rhythm，2006，3(6)：728-736.

[9]Xin P，Pan Y，Zhu W，et al.Favorable effects of resveratrol on sympathetic neural remodeling in rats following myocardial infarction[J].Eur J Pharmacol，2010，649(1-3)：293-300.

[10]Hasan W，Jama A，Donohue T，et al.Sympathetic hyperinnervation and inflammatory cell NGF synthesis following myocardial infarction in rats[J].Brain Res，2006，1124(1)：142-154.

[11]Liao KK，Wu MJ，Chen PY，et al.Curcuminoids promote neurite outgrowth in PC12 cells through MAPK/ERK-and PKC-dependent pathways[J].J Agric Food Chem，2012，60(1)：433-443.

[12]Gupta SK，Mishra R，Kusum S，et al.GAP-43 is essential for the neurotrophic effects of BDNF and positive AMPA receptor modulator S18986[J].Cell Death Differ，2009，16(4)：624-637.

[13]Takei H，Buckleair LW，Rivera A，et al.Brain tissue microarrays in neurodegenerative diseases：validation of methodology and immun-ohistochemical study of growth-associated protein-43 and calretinin[J].Pathol Int，2007，57(12)：775-783.

[14]邓志云.GAP-43的研究进展及其与周围神经再生的关系[J].南昌大学学报：医学版，2012，52(6)：94-97.

[15]Tedeschi A，Nguyen T，Puttagunta R，et al.A p53-CBP/p300 trans-cription module is required for GAP-43 expression，axon outgrowth，and regeneration[J].Cell Death Differ，2009，16(4)：543-554.

[16]Lee YL，Blaha MJ，Jones SR.Statin therapy in the prevention and treatment of atrial fibrillation[J].J Clin Lipidol，2011，5(1)：18-29.

[17]辛平，魏盟，黄石安，等.阿托伐他汀对急性心肌梗死大鼠交感神经重构的影响[J].临床心血管病杂志，2010，26(5)：385-388.

Effects of Rosuvastatin on Sympathetic Neural Remodeling of Left Atrium in Rats after Myocardial InfarctionΔ

LU Qinghua1, GU Mingming2, WEI Changchun3, LU Peng1, LIU Jing4

(1.Dept.of Pharmacy, Shandong Taishan Hospital, Shandong Taian 271000, China; 2.Dept.of Traditional Chinese Medicine, Shandong Ningyang County the First People’s Hospital, Shandong Taian 271000, China; 3.Dept.of Nursing, Shandong Taishan Hospital, Shandong Taian 271000, China; 4.Dept.of Cardiology, Shandong Taishan Hospital, Shandong Taian 271000, China)

ABSTRACTOBJECTIVE：To investigate the effects of rosuvastatin on sympathetic neural remodeling of left atrium(LA) in rats after myocardial infarction(MI) and the mechanism of action. METHODS: 60 male wistar rats were randomly divided into sham operation group (sham group), MI+ rosuvastatin intervention group (rstatin group), and MI group (MI group). Immunohistochemistry was used to analyze the left stellate ganglion(LSG) in rats and nerve growth factor(NGF) in atrial tissue, positive materials of growthassociated protein 43(GAP-43), and then the distribution and density of nerve fiber were reflected. The expression levels of the proteins were quantified by Western blotting. RESULTS: LSG in rats, GAP-43 in atrial tissue and positive nerve density of NGF in rstatin group and MI group were significantly higher than those of sham group, with statistically significant difference(P<0.01); yet rstatin group were lower than MI group, with statistically significant difference(P<0.01). The protein expression of LSG and GAP-43 in rstatin group and MI group were significantly higher than those of sham group, with statistically significant difference(P<0.01); yet rstatin group were lower than MI group, with statistically significant difference(P<0.01). Meanwhile, the protein expression of LSG and NGF were significantly higher than those of sham group, with statistically significant difference(P<0.01); yet there was no significance between rstatin group and MI group(P>0.05). CONCLUSIONS: Rosuvastatin could effectively improve the sympathetic neural remodeling of LA in MI rats. The mechanism might be associated with the direct inhibition of expression and protein synthesis of GAP-43 in LSG and NGF in LA.

KEYWORDSMyocardial infarction; Rosuvastatin; Neural remodeling

Δ基金项目：2014年深圳市科创委科技计划资助项目(No.JCYJ20140414160300581)

中图分类号R972+.6

文献标志码A

文章编号1672-2124(2016)05-0624-05

DOI10.14009/j.issn.1672-2124.2016.05.020

(收稿日期：2015-12-10)

*副主任药师，博士。研究方向：天然药物化学。E-mail：jilinwb@163.com