广西人群中IL-33基因rs10975521A/T、rs1929992A/G 多态性的分布特点①

郭　静　向　阳　彭友帆　韦叶生　蓝　艳

(右江民族医学院附属医院皮肤科,百色 533000)

广西人群中IL-33基因rs10975521A/T、rs1929992A/G 多态性的分布特点①

郭静向阳②彭友帆②韦叶生②蓝艳

(右江民族医学院附属医院皮肤科,百色 533000)

[摘要]目的：研究探讨IL-33基因rs10975521A/T、rs1929992A/G的基因多态性在广西人群中的分布特点。分析两位点的基因型及基因频率在不同种族间的分布差异。方法：采用单碱基延伸法(PCR-SEB)及DNA测序法对283例受试者IL-33基因rs10975521A/T、rs1929992A/G位点进行多态性分析。用统计学方法分析其分布频率及组间差异。结果：rs10975521A/T 存在AA、AT、TT三种基因型，分布频率分别为12.7%、53.0%、34.3%。其各基因型及等位基因频率在广西人群中男女性别之间无显著差异(P>0.05)。其等位基因频率与人类基因组计划公布的欧洲人(P<0.05)、北京汉族人(P<0.05)及日本人群(P<0.01)之间均有显著差异。rs1929992A/G存在AA、AG、GG三种基因型，分布频率分别为23.9%、53.7%、13.4%。其各基因型及等位基因频率在广西地区人群中男女之间也无统计医学意义(P>0.05)。其基因型与欧洲人(P<0.01)、北京汉族人(P<0.05)和日本人(P<0.01)之间差异有统计学意义。等位基因频率与欧洲人(P<0.01) 、北京汉族人(P<0.05) 相比差异有统计学意义。结论：IL-33基因rs10975521A/T、rs1929992A/G的基因多态性在种族和地区间存在不同程度的差异。

[关键词]IL-33 ；基因多态性 ；广西人群

白细胞介素33(Interleukin-33，IL-33)是白细胞介素1(Interleukin-1，IL-1)家族中的新成员，又称为IL-1F11，被Schmitz等[1]发现于2005年。其作用复杂，功能多面，在全身多组织器官中都有所分布。IL-33是一种多功能蛋白，一方面，它参与T淋巴细胞介导的免疫应答，促进肥大细胞产生其他至炎因子，在多种疾病及生理过程中发挥作用。另一方面，还可以在细胞核内起到转录因子的作用[2-5]。研究发现，IL-33在炎症、微生物感染、自身免疫性疾病及心血管疾病中都有所参与[6]。近年来，随着研究的深入与人类基因组扫描的不断完善， IL-33的基因多态性对疾病的影响逐渐被重视，我们在人类基因组扫描图谱所公布的IL-33基因SNP位点数据中，筛选出次要等位基因频率>10%的两个SNP位点rs10975521A/T和rs1929992A/G，并研究其在广西人群中的分布频率，为深入研究IL-33的基因多态性在不同种族、地区间的分布及其在疾病中的影响打下基础。

1对象与方法

1.1对象研究对象共283例，男72例，女211例。年龄19～65岁 。样本取自右江民族医学院附属医院的体检中心，筛选出日常生活功能良好，无心脑血管疾病，感染性疾病及自身性免疫性疾病，各项体检指标均无异常且相互无血缘关系的健康体检者作为研究对象。所有研究对象均来自广西地区，采集标本前均已签署知情同意书。此研究已通过本单位的伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1DNA提取取静脉血2 ml,加入EDTAN2抗凝。用(亚能生物TM全血DNA快速提取试剂盒)提取DNA，-70℃保存。

1.2.2引物的合成通过primer3在线软件(http://primer3.ut.ee/)设计引物，由上海天昊生物科技有限公司进行合成。rs10975521A/T上游引物：TTGCATGCCAACAACAAGGAAC，下游引物：CCCCAACACCCAAATCTACACAA，延伸引物：TTTT-TTTTTTTGACAGTTCTGTAATCATATATATAGATATA-GATAA rs1929992A/G，上游引物：TCCCATGGTCATTAGTTTTGGTGA，下游引物：TTGAAGTCATCATCAACTTGGAACCT，延伸引物:TTTTTTTTTTTCCCCCCAAATTTCAA。

1.2.3PCR扩增及基因测序扩增反应体系共20 μl，包含1.0 μl模板DNA,2.0 μl PCR缓冲液,2.0 μl dNTPs,1.0 U TaqDNA聚合酶,以及两端引物各1.0 μl。剩余体积用灭菌双蒸水补足20 μl。使用热启动Taq 酶(Qiagen 公司)进行多重PCR 所获得的PCR产物，通过虾碱酶(SAP)(Promega公司)和外切酶I (Epicentre公司)进行纯化。延伸反应使用ABI公司的SNaPshot Multiplex kit来进行。延伸产物在ABI3730XL上样并用GeneMapper4.1分析其基因多态性。并采用测序法进一步验证我们的结果。

1.3统计学分析用SPSS13.0统计软件包分析数据。各位点基因型及等位基因频率采用直接计数法，两组间基因型及等位基因的频率分布差异采用χ2检验，P<0.05代表差异有统计学意义。遗传平衡分析用Hardy-Weinberg平衡检验。

2结果

2.1IL-33基因位点rs10975521A/T、rs1929992A/G的基因分型经Hardy-Weinberg平衡检验分析，两位点基因型均达Hardy-Weinberg平衡，结果具有群体代表性。rs10975521A/T与rs1929992A/G两位点扩增产物分别为124 bp与210 bp。rs10975521A/T存在AA、AT、TT三种基因型。rs1929992A/G存在AA、AG、GG三种基因型。基因测序证实了我们的检验结果(见图1、2)。

2.2两位点基因型及等位基因频率在广西人群中的分布IL-33基因rs10975521A/T 的三个基因型:AA、AT和TT在男女两组间分布差异无统计学意义(P>0.05)。rs1929992A/G的三个基因型:AA、AG和GG在男女两组间分布差异也无统计学意义(P>0.05)。两位点的各等位基因频率在男女两组间分布差异也无统计学意义(P>0.05)见表1。

2.3两位点基因型及等位基因频率在各种族人群间分布经分析，广西人群rs10975521A/T各等位基因频率与欧洲人(P<0.05)、北京汉族人(P<0.05)及日本人(P<0.01)相比，均有显著性差异。与非洲黑人相比无显著差异(P>0.05)。Hapmap数据库尚未公布rs10975521A/T位点在各人群中基因型及等位基因频率数据，四个人群的等位基因频率数据来自NCBI数据库。

图1　IL-33基因rs10975521A/T测序图Fig.1　Sequencing map of genotype for IL-33 genersrsrs10975521A/T polymorphismNote: Arrow of panels ①-③ showed AA，AT and TT genotypes,respectively.

图2　IL-33基因rs1929992A/G测序图Fig.2　Sequencing map of genotype for IL-33 gene rs1929992A/G polymorphismNote: Arrow of panels ①-③ showed AA，AG and GG genotypes,respectively.

广西人群rs1929992A/G各基因型分布频率与欧洲人(P<0.01)、日本人(P<0.01)、北京汉族人(P<0.05)相比具有显著差异。与非洲黑人相比无显著差异(P>0.05)。其等位基因分布频率与欧洲人(P<0.01)、北京汉族人(P<0.05)之间差异有统计学意义。与非洲黑人、日本人之间无统计学意义(P>0.05)。见表2、3。

表1广西人群IL-33基因rs10975521A/T、rs1929992A/G 基因型和等位基因频率的比较

Tab.1Distribution of genotype and allele frequencies of IL-33 gene rs10975521A/T and rs1929992A/G in Guangxi population

RSandGendernGenotypefrequencies(%)AA(AA)AT(AG)TT(GG)Allelefrequency(%)A(A)T(G)Rs10975521Male729(12.5)38(52.8)25(34.7)56(38.9)88(61.1)Female21127(12.8)112(53.0)72(34.1)166(39.3)256(60.6)Total28336(12.7)150(53.0)97(34.3)222(39.2)344(60.8)Rs1929992Male7224(33.3)38(52.8)10(13.9)86(59.7)58(40.3)Female21169(32.7)114(54.1)28(13.2)252(59.7)170(40.3)Total28393(23.9)152(53.7)38(13.4)338(59.7)228(40.3)

Note：Genotype and allele frequencies of IL-33 gene showed no significant difference among same group of male and female(P> 0.05).

表2广西人群rs10975521A/G基因型和等位基因分布频率与各种族人群间的比较

Tab.2Comparison of frequency of IL-33 gene rs10975521A/G polymorphism among different ethic and regional groups

GroupsnGenotypefrequencies(%)AAATTTAllelefrequency(%)ATGuangxipeople28336(12.7)150(53.0)97(34.3)222(39.2)344(60.8)HapMap-CEU1)120---73(30.3)167(69.7)HapMap-YRI2)118---102(43.1)134(56.9)HapMap-HCB1)120---114(47.6)126(52.4)HapMap-JPT1)120---136(56.7)104(43.3)

Note：Hapmap database is still not released corresponding values，Allele frequency is derived from the NCBI databases；1)Allele frequencies,bothP<0.05,compared with the Guangxi crowd;2)Allele frequencies,P>0.05,compared with the Guangxi crowd.

表3广西人群rs1929992A/G基因型和等位基因分布频率与各种族人群间的比较

Tab.3Comparison of frequency of IL-33 gene rs1929992A/G polymorphism among different ethic and regional groups

GroupsnGenotypefrequencies(%)AAAGGGAllelefrequency(%)AGGuangxipeople28393(23.9)152(53.7)38(13.4)338(59.7)228(40.3)HapMap-CEU1)12060(50.0)50(41.7)10(8.3)170(70.8)70(29.2)HapMap-YRI2)11842(35.6)56(47.5)19(16.9)140(59.3)94(40.7)HapMap-HCB1)9020(22.2)48(53.3)22(24.4)88(48.9)92(51.1)HapMap-JPT3)8834(38.6)28(31.8)26(29.5)96(54.5)80(45.5)

Note：1)Allele and genotype frequencies,bothP<0.05,compared with the Guangxi crowd;2) Allele and genotype frequencies,bothP>0.05,compared with the Guangxi crowd；3)Genotype frequencies,P<0.01,allele,P>0.05.

3讨论

IL-33位于人类的第9号染色体上，编码270个氨基酸。IL-33主要在人体纤维母细胞、内皮细胞、上皮细胞、尤其是在呼吸道及消化道上皮细胞中高表达[1]。在静止时，IL-33仅限于在细胞核内，发挥其转录因子的作用。而受到炎症等刺激后，IL-33与其受体ST2结合，可刺激其下游信号分子聚集，并诱导Th2细胞因子，参与炎症反应和免疫调控。IL-33还是一种“预警因子”，在细胞坏死时，IL-33可从细胞核中释放，进而在中性粒细胞的作用下刺激多种炎症因子参与免疫调控[6]。IL-33在多种疾病的病理过程度有所参与，而且IL-33在机体免疫发挥作用时，具有双面性。在寄生虫感染、动脉粥样硬化、肥胖等疾病中，IL-33是一种保护因子[7，8]。而在过敏性鼻炎，类风湿关节炎，多发性硬化以及脓毒血症中又扮演着风险因子的角色[9-11]。近年来，越来越多的研究者对IL-33产生了浓厚的兴趣。有文献报道，IL-33的血清水平在多种自身免疫性疾病中呈现高表达状态，而IL-33的基因多态性与动脉粥样硬化、类风湿关节炎、炎症性肠病等也具有相关性[12,13]。

广西地处中国西南边界地区，共有40多个民族长期共居，其地理环境独特，与外界往来较少，生活环境相对封闭。从我们研究的结果可以看出，广西人群IL-33基因rs10975521A/G 位点的等位基因频率与欧洲人(P<0.05)、北京汉族人(P<0.05)、日本人(P<0.01)相比都存在着显著差异。而IL-33基因rs1929992A/G位点的多态性虽然与非洲黑人和北京汉族人之间差异不大(P均 >0.05)，但是与欧洲人(P均<0.01)、日本人(P<0.05)相比仍表现出较大差异。这也体现了IL-33基因在种族之间所存在的差异性。

基因多态性的分布特点因地域不同，种族不同，环境影响和自然选择而存在着很大差异。我们的研究结果也体现了这一特性。基因多态性是一种普遍存在现象，这种突变与人类的进化，环境的选择以及病理的诱导都有着密切的联系，rs10975521C/T、 rs1929992A/G位于IL-33基因的内含子区，内含子区的位点的突变有可能会影响基因的转录，影响基因的表达调控和功能[14]，从而参与各种病理生理过程。随着全基因组扫描图谱的建立，以及在基因组关联研究技术的帮助下，让更多的研究者对基因多态性和疾病的关系也有了全新的认识。我们对广西人群IL-33基因多态性进行研究，并分析了其在多种族人群之间的分布差异。不仅为IL-33基因多态性在人类分布中的研究供了有用基础资料，更为相关疾病的前瞻性研究打下了分子生物学层面的基础。

参考文献：

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[2]Saluja R,Khan M,Church MK,etal.The role of IL-33 and mast cells in allergy and inflammation[J].Clin Transl Allergy,2015,29(5):33-40.

[3]Ni Y,Tao L,Chen C,etal.The Deubiquitinase USP17 Regulates the Stability and Nuclear Function of IL-33[J].Int J Mol Sci,2015,16(11):27956-27966.

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[14]Jo BS,Choi SS.Introns:The Functional Benefits of Introns in Genomes[J].Genomics Inform，2015，13(4):112-118.

[收稿2016-01-12修回2016-02-16]

(编辑许四平)

Distribution characteristics of rs10975521A/T and rs1929992A/G polymorphism of IL-33 gene in Guangxi population

GUO Jing, XIANG Yang,PENG You-Fan,WEI Ye-Sheng,LAN Yan.

Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China

[Abstract]Objective:To study and explore the distribution characteristics of rs10975521A/T and rs1929992A/G polymorphism of the IL-33 gene in Chinese Guangxi population.To compare the frequency distribution differences of allele and genotype of two sites among different ethnic.Methods: The polymorphism of rs10975521A/T and rs1929992A/G of IL-33 gene in 283 subjects were analyzed with the methods of Single base extension (PCR-SEB) and DNA sequencing,and the distribution frequency and the differences between groups of that were analyzed statisticaly.Results: Three genotypes of AA，AT and TT were found in rs10975521A/T with the frequency distribution of 12.7%,53.0% and 34.3% respectively and there was no significant difference between sexes of each genotype and allele frequency in the Guangxi population (P>0.05).There were significant differences of the allele frequency of rs10975521A/T in the Guangxi population compared with that in the European (P< 0.05), han Chinese in Bejing (P< 0.05) and Japanese people (P< 0.01).Three genotypes of AA,AG and GG were found in rs1929992A/G with the frequency distribution of 23.9%,53.7% and 13.4% respectively and there was no significant difference between sexes of each genotype and allele frequency in the Guangxi population(P> 0.05),but the differences of genotype frequency of rs1929992A/G was statistically significant compared with that in the European,han Chinese in Bejing and Japanese people (P< 0.05). There were significant differences of the allele frequency between Guangxi population and European (P< 0.01),han Chinese in Bejing(P< 0.05).Conclusion: There are different degrees of discrepancy of rs10975521A/T and rs1929992A/G polymorphism of IL-33 gene among different race and region.

[Key words]IL-33;Gene polymorphism;Guangxi population

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.017

作者简介：郭静(1987年-),女,在读硕士，主要从事系统性红斑狼疮免疫机制的研究，E-mail：gjnsdy-1987@163.com。 通讯作者及指导教师：蓝艳(1973年-),女，教授，硕士生导师，主要从事系统性红斑狼疮免疫机制的研究，E-mail：yylanyan@163.com。

中图分类号Q347

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)06-0849-04

①本文为国家自然科学基金(81260234；81560552)、广西研究生教育创新计划项目(YCSZ2015223)和右江民族医学院校级课题(yy2015zd001)。

②右江民族医学院附属医院检验科，百色533000。