凡纳滨对虾新过敏原烯醇化酶的鉴定

谈思怡　黄建芳　孙一帆　郭成斌　向军俭

(暨南大学抗体工程研究中心 暨南大学广东省分子免疫与抗体工程重点实验室,广州市疾病与食品安全免疫学快速检测重点实验室,广州510632)

凡纳滨对虾新过敏原烯醇化酶的鉴定

谈思怡黄建芳孙一帆郭成斌向军俭

(暨南大学抗体工程研究中心 暨南大学广东省分子免疫与抗体工程重点实验室,广州市疾病与食品安全免疫学快速检测重点实验室,广州510632)

[摘要]目的：鉴定凡纳滨对虾分子量为47 kD过敏原的性质。方法：采用丙酮沉淀法提取凡纳滨对虾总蛋白，通过SDS-PAGE、11例虾过敏患者血清IgE的Western blot 分析凡纳滨对虾中过敏原组份，运用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(Matrix-Assisted laser desorption ionization/time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF-MS)鉴定凡纳滨对虾47 kD未知过敏原组分。结果：通过 SDS-PAGE电泳证明所提取的凡纳滨对虾总蛋白组分完全。Western blot 结果显示，凡纳滨对虾至少有14种与阳性血清反应的组分，其中，55%的虾过敏患者IgE与分子量为47 kD的蛋白分子发生特异性反应，质谱分析结果显示47 kD蛋白为烯醇化酶。结论：烯醇化酶是凡纳滨对虾的一种新的过敏原。

[关键词]凡纳滨对虾；过敏原；烯醇化酶；质谱；Western blot

食物过敏现象已经成为一个常见的公共卫生问题，据统计在发达国家食物过敏影响了大约2%成年人和8%儿童的日常生活甚至生命安全[1]。甲壳类食物作为粮食农业组织(Food and Agriculture Organization，FAO)/世界卫生组织(World Health Organization，WHO)认定的八大过敏食物之一[2]。在一些沿海国家例如中国、日本，因食用甲壳类食物而导致食物过敏的患者逐年增多[3]。

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是当今世界养殖产量最高的三大虾类之一，是我国南方地区的主要养殖虾种。由于其卡路里含量低，营养价值高而深受人们的喜爱[4]。因此，由其引起的食物过敏在我国也较为常见。1981年在虾中确定了第一个过敏原，38～41 kD的原肌球蛋白(Tropomyosin,TM)，是虾中最主要的过敏原；其他已被证实的重要过敏原还包括40 kD的精氨酸激酶(Arginine kinase,AK)、20 kD的肌球蛋白轻链(Myosin light chain,MLC)、20～22 kD的肌质钙结合蛋白(Sarcoplasmic calcium-binding protein,SCP)及75 kD的血蓝蛋白(Hemocyanin，Hc)；除此之外，一些次要过敏原如：21 kD的钙肌蛋白C(Troponin C,Tn C)、28 kD的磷酸丙糖异构酶(Triose Phosphate isomerase,TIM)、225 kD的肌球蛋白重链(Myosin heavy chain，MHC)等也相继被鉴定[5-7]。

在前期研究工作中，通过对虾过敏患者血清样本分析，我们发现除了已明确的几个过敏原外，凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)中的47 kD蛋白组分也具有较高的血清IgE反应率，且颜色较深[8]。继而，本研究旨在探讨凡纳滨对虾中是否存在新的过敏原，为进一步丰富虾过敏原组分的认识提供研究基础。

1材料与方法

1.1实验材料新鲜凡纳滨对虾购自广州黄沙水产市场；蛋白 Mr marker购自Thermo公司；PVDF膜购自Millipore公司；HRP 标记羊抗人IgE 二抗购自Bethly公司；化学发光底物试剂盒购自弗德生物；胰酶购自美国Promega 公司；垂直板型电泳仪、膜转移系统、凝胶成像系统均购自Bio-Rad公司；低温高速冷冻离心机购自Eppdof公司；4800 PLUS MALDI-TOF/TOF 质谱仪购自美国ABI公司。

1.2实验方法

1.2.1凡纳滨对虾总蛋白的提取取新鲜的活虾去头去壳后取肌肉组织，用组织捣碎机捣碎。参照《变态反应学实验技术》[9]中的方法，将捣碎的组织用50%预冷丙酮浸泡，4℃搅拌4 h，8 500 r/min离心15 min，收集沉淀。重复脱脂一次。沉淀物置于通风橱室温彻底风干后，浸入0.1 mol/L PBS(pH7.4)中，4℃搅拌1 h，静置过夜，12 000 r/min 4℃离心20 min取上清；用BCA试剂盒测蛋白浓度，分装后于-20℃储存。

1.2.2血清来源虾过敏患者血清5份来自暨南大学在校师生过敏患者， 6份来自广东省妇幼保健医院的虾过敏患者，共11份。患者年龄1～40岁，其中男性6例，女性5例，阳性血清纳入标准为患者有典型的食物过敏史，临床确诊为虾过敏患者。阴性对照血清2份，男女志愿者等比例，年龄分别为26岁、22岁，纳入标准为无家族过敏史，无食物过敏史。将采集的血液37℃静置30 min后4℃静置过夜，2 000 r/min 离心10 min，分装后于-20℃储存。

1.2.3SDS-PAGE电泳分析配置12%的分离胶，5%的浓缩胶；虾蛋白样品与上样缓冲液1∶5混合，煮沸5～10 min变性，取适量样品上样。80 V，30 min恒压使样品在浓缩胶中压缩成一条线，120 V恒压电泳分离，以溴酚蓝为指示，当其跑至终点后停止电泳。用考马斯亮蓝R-250染液染色2～4 h后，脱色液脱色至出现清晰的蛋白条带。

1.2.4Western blot分析虾蛋白粗提液经SDS-PAGE分离后，100 V恒压，60 min 用Bio-Rad电转移系统将凝胶中用的蛋白转移至 PVDF 膜上，5%脱脂奶粉 37℃封闭2 h，PBST 洗涤三次，每次10 min。人血清用PBS-T 稀释10倍，37℃ 孵育2 h，PBST洗涤三次，每次10 min。HRP标记羊抗人IgE 二抗(1∶1 000)37℃ 孵育1 h，PBST 洗涤三次，每次10 min。加入Ecl化学发光试剂，凝胶成像系统曝光后扫描保存结果。

1.2.5质谱鉴定与分析凡纳滨虾蛋白粗提液进行SDS-PAGE分离后考马斯亮蓝G-250染色、脱色，将目的蛋白条带切成胶粒进行胶内蛋白质酶解，提取肽段用ABI4800 MALDI-TOF/TOF-MS串联飞行时间质谱仪进行指纹图谱(PMF)检测，质谱操作采用正离子反射模式,质谱分析使用标准肽混合物作为外标校正，从一级质谱中选择信噪比大于50的得分最高的前体离子做MS/MS分析，然后进行IPI数据库搜索，搜索的参数设置如下：种类为虾，切割酶 Trypsin， 允许最大漏切位点数(Missed cleavage)为 1，可变修饰为cysteine carboamido methylated和methionine oxidized，无固定修饰。MS 的误差 100 ppm，MS/MS 的误差为0.6 Da。得分超过53被认为超过阈值(P≤0.05)，为可信的鉴定结果。

2结果

2.1凡纳滨对虾总蛋白组分分析虾蛋白粗提液按16 μg上样的SDS-PAGE，结果如图1所示，至少有14条明显的蛋白条带。其中分子量为20、38、40、75 kD分别为已知的过敏原肌质钙结合蛋白、原肌球蛋白、精氨酸激酶及血蓝蛋白。

2.2Western blot鉴定过敏原组分过敏患者血清IgE与凡纳滨对虾蛋白粗提液进行Western blot，2 例无过敏史的健康人血清做阴性对照。结果显示，除分子量为38 kD的原肌球蛋白、40 kD的精氨酸激酶及75 kD的血蓝蛋白外，在11例过敏患者中，有6例患者血清IgE能与分子量为47 kD的蛋白分子发生特异性反应，反应率为 55%,且反应条带明显。说明分子量为47 kD蛋白是凡纳滨对虾的过敏原之一(图2)。

图1　凡纳滨对虾总蛋白SDS-PAGEFig.1　SDS-PAGE of proteins from Litopenaeus vannameiNote: M.Protein marker ；1.Litopenaeus vannamei.

表1匹配片段质谱分析结果

Tab.1MALDI-TOF/TOF results of matched peptides

ObservedMr(expt)Mr(calc)DeltaStartEndMissIonsPeptide2331.13452330.12722330.11080.01641210133-.LAMQEFMILPTGASSFTEAMR.M2331.13452330.12722330.11080.01641210--.LAMQEFMILPTGASSFTEAMR.M1769.02261768.01531767.87600.139422361-R.LVVCACYRLSVSDAR.N1782.90391781.89661781.78330.113337501-R.NCCIKFGSCCHLVK.-1230.71131229.70401229.69790.006126361-K.QTGLEQSVKIK.K2283.15012282.14282282.07360.06921461641-R.LSNEKAYQEINDTQEMIEK.I1895.03451894.02721893.88120.14611341491-R.SMLDEERMDALESQLK.E2331.13452330.12722330.21910.09192232431-K.IVLMHDIYATSADAAEEIIKK.L1895.03451894.02721893.90430.12302692850-R.ACYAVSVAVQNYHGIDK.D

图2　凡纳滨对虾蛋白粗提液与患者血清 IgE的Western blot鉴定Fig.2　Identification of allergens in crude extracts by Western blotNote: M.Protein marker;1-2.Negative controls;3-8.Allergic patients′ serum.

2.3质谱鉴定分析结果凡纳滨对虾47kD过敏原经胰蛋白酶酶切后的肽段混合物进行MALDI-TOF/TOF-MS质谱分析，结果见图3、表1。图3A为该蛋白的一级质谱，从一级质谱图中选择强度较高的肽段进行串联质谱分析，得到的MS/MS 图谱经检索，最终给出了Mowse分值(图3B)。凡纳滨对虾47 kD过敏原与岩虾属的烯醇化酶高分值匹配。普库索取号为gi:344049993，Mascot得分为142，覆盖率达15%，等电点4.42。结果表明凡纳滨对虾47 kD过敏原为烯醇化酶。

3讨论

烯醇化酶是催化2-磷酸-甘油酸失水而生成磷酸烯醇丙酮酸反应的酶，属于糖酵解体系，在细胞能量代谢过程中起重要的作用。Nahm等人发现α-烯醇化酶作为体内自身抗原可以引起严重哮喘[10]。Nittner等人通过皮肤点刺实验证明啤酒酵母中的主要过敏原为烯醇化酶，可诱发呼吸道过敏反应[11]；烯醇化酶被认为是一类高度保守的真菌过敏原[12,13]。Liu采用双向结合质谱分析手段从武昌鱼中鉴定出两种新的过敏原即烯醇化酶和肌酸激酶[14]。近期德国学者也从鳕鱼、鲑鱼和金枪鱼中确认鱼烯醇化酶和醛缩酶是新的重要的鱼过敏原。在鱼类过敏诊断中IgE与烯醇化酶和醛缩酶特异结合，尤其是在小清蛋白缺乏时[15]。此外，烯醇化酶作为过敏原在德国小蠊中也被发现[16]。

图3　凡纳滨对虾 47 kD过敏原蛋白的肽指纹图谱Fig.3　Identification of shrimp allergen at 47 kD by mass spectrometrNote: A.Peptide mass finger print of suspected protein;B.Probability based mowse score.

在甲壳类过敏原研究中，有文章发现一蛋白点与磷酸丙酮酸水合酶和烯醇化酶两种蛋白相匹配，两种蛋白的相似度可达 99%，其中肽段198Gly-Lys221与40多个物种的烯醇化酶相匹配，可作为烯醇化酶的通用特征肽和磷酸丙酮酸水合酶的特征肽[17]，暗示烯醇化酶可能为一种过敏原。2014年泰国学者也通过质谱分析技术在墨吉明对虾肌肉组织中发现了47 kD的烯醇化酶可能是一种未见报道的虾过敏原[18]。

本研究从凡纳滨对虾中分离出能与虾过敏患者血清反应的47 kD蛋白组分，通过蛋白组学质谱鉴定方法，证明凡纳滨对虾47 kD蛋白组分为烯醇化酶，这也肯定了国外学者的相关报道[18]。作为一种新的虾过敏原，根据本实验分析鉴定结果，约55% 虾过敏患者IgE与烯醇化酶过敏原发生特异性反应，初步可以证明烯醇化酶是凡纳滨对虾过敏原之一。但受到样本数量的限制，烯醇化酶是否为凡纳滨对虾的主要过敏原还有待进一步的验证。本研究进一步丰富了对凡纳滨对虾过敏原组分的认识，为探寻新的虾过敏原检测试剂、及脱敏疫苗的研发提供重要实验依据。

参考文献：

[1]Zheng LN,Lin H,Pawar R,etal.Mapping IgE binding epitopes of major shrimp(Penaeus monodon)allergen with immunoinformatics tools[J].Food Chemical Toxicology,2011,49(11):2954-2960.

[2]Sicherer SH,Sampson HA.Food allergy[J].J Allergy Clinical Immunol,2010,125(2):S116-S125.

[3]Morii A,Mita H,Ishizaki S,etal.Importance of conformation for the IgE reactivity of sarcoplasmic calcium-binding protein from the black tiger shrimp penaeus monodon[J].Eur Food Res Technol,2013,236(1):165-170.

[4]陈惠芳,赖荷,黄于艺.凡纳滨对虾过敏原蛋白 Lit v 1.2 的原核表达与纯化[J].中国免疫学杂志,2015,31(12):1659-1662.

[5]Pedrosa M,Boyano-Martínez T,García-Ara C,etal.Shellfish allergy:a comprehensive review[J].Clin Rev Allergy Immunol,2015,49(2):203-216.

[6]孙一帆,黄建芳,向军俭,等.凡纳滨对虾过敏原精氨酸激酶的质谱鉴定及其免疫交叉反应研究[J].食品科学,2015,36(1):170-173.

[7]张盈莹,朱黎娜,李韶深,等.血蓝蛋白是中华绒鳌蟹重要的高分子量过敏原[J].中国免疫学杂志,2015,31(10):1375-1379.

[8]孙一帆,黄建芳,王彩霞,等.中国人的虾,蟹致敏过敏原组分分析[J].中国免疫学杂志,2014,30(10):1325-1329.

[9]乔秉善.变态反应学实验技术[M].第2版.北京：中国协和医科大学出版社，2002：6-36.

[10]Nahm DH,Lee KH,Shin JY,etal.Identification of α-enolase as an autoantigen associated with severe asthma[J].J Allergy Clinical Immunol,2006,118(2):376-381.

[11]Marita NM,Irena WK,Ewa B,etal.Skin prick test response to enzyme enolase of the baker′s yeast(Saccharomyces cerevisiae)in diagnosis of respiratory allergy[J].Med Sci Monitor,2001,7(1):121-124.

[12]唐宁枫.白念珠菌的烯醇化酶[J],国外医学:皮肤性病学分册,1999,25(3):158-160.

[13]Simon-Nobbe B,Probst G,Kajava AV,etal.IgE-binding epitopes of enolases,a class of highly conserved fungal allergens[J].J Allergy Clinical Immunol,2000,106(5):887-895.

[14]Liu R,Krishnan H B,Xue W,etal.Characterization of allergens isolated from the freshwater fish blunt snout bream(Megalobrama amblycephala)[J].J Agricultural Food Chem,2010,59(1):458-463

[15]Kuehn A,Hilger C,Lehners-Weber C,etal.Identification of enolases and aldolases as important fish allergens in cod,salmon and tuna:component resolved diagnosis using parvalbumin and the new allergens[J].Clin Exper Allergy,2013,43(7):811-822.

[16]Chuang JG,Su SN,Chiang BL,etal.Proteome mining for novel IgE-binding proteins from the German cockroach(Blattella germanica)and allergen profiling of patients[J].Proteomics,2010,10(21):3854-3867.

[17]刘一璇，林洪，吴丽莎，等.加工方式对刀额新对虾主要过敏原免疫原性的影响[J].水产学报，2011，123(31)：420.

[18]Khanaruksombat S,Srisomsap C,Chokchaichamnankit D,etal.Identification of a novel allergen from muscle and various organs in banana shrimp(Fenneropenaeus merguiensis)[J].Ann Allergy Asthma Immunol,2014,113(3):301-306.

[收稿2016-03-02修回2016-03-29]

(编辑许四平)

Identification of a new shrimp allergen enolase from Litopenaeus vannamei

TAN Si-Yi，HUANG Jian-Fang ，SUN Yi-Fan，GUO Cheng-Bin，XIANG Jun-Jian.

Antibody Engineering Research Center of Ji′nan University,Guangdong Province Key Laboratory of Molecular Immunology and Antibody Engineering，Guangzhou Key Laboratory of Disease and Food Safety Rapid Test，Guangzhou 510632，China

[Abstract]Objective:To identify enolase,47 kD allergen,from Litopenaeus vannamei by Mass spectrometry.Methods: The proteins were extracted from Litopenaeus vannamei tissue with acetone precipitation method.The protein components were analyzed by SDS-PAGE and Western blot.By using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF/TOF-MS),the 47 kD allergen from Litopenaeus vannamei was identified as enolase.Results: By SDS-PAGE,we proved that the native protein components from Litopenaeus vannamei were completely.According to the Western blot result more than 14 components could react with the positive serum.MALDI-TOF/TOF analysis results showed that the suspected proteins were enolase.A sensitization frequency was 55%.Conclusion: Enolase was identified as a new allergen of Litopenaeus vannamei.

[Key words]Litopenaeus vannamei;Allergen;Enolase;Mass spectrometry;Western blot

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.06.008

作者简介：谈思怡(1989年-)，女，在读硕士，主要从事肿瘤免疫及食物过敏原方面研究。 通讯作者及指导教师：向军俭(1952年-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事工程抗体及其应用和过敏原研究，E-mail:txjj@jnu.edu.cn。

中图分类号R392.1

文献标志码A

文章编号1000-484X(2016)06-0808-04